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目的:乳腺癌严重危害妇女身心健康,全球乳腺癌发病率仍旧高居女性恶性肿瘤发病率第一位,死亡率排第二位。三阴性乳腺癌缺乏孕激素受体、雌激素受体和人表皮生长因子受体2的表达,目前尚无有效的靶向治疗药物。因此,寻觅用于治疗三阴性乳腺癌的新型靶点十分迫切。SASH1（SAM和SH3结构域1）是SLY信号转接器蛋白家族的成员,抑制多种肿瘤细胞迁移和侵袭。SASH1在肝转移性结肠癌和侵袭性乳腺癌等多种肿瘤组织中表达较低,且低表达SASH1与肿瘤预后不良密切相关。对30例三阴性乳腺癌的SNP标记筛选发现,SASH1是三阴性乳腺癌的一个重要遗传风险因子,但尚不清楚SASH1在三阴性乳腺癌中的抑癌作用机制。目前有关SASH1参与的信号转导机制的研究报道较少。Liu等发现,SASH1通过抑制宫颈癌细胞的FAK表达水平,进而抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭。有文献报道结肠癌中,SASH1可与F-肌动蛋白结合引起肌动蛋白聚合,并与cortactin存在共定位,而cortactin与细胞迁移及粘着相关,这一结果初步揭示了SASH1表达下调促进结肠癌转移和发展的可能机制。另有研究表明,SASH1通过SASH1-IQGAP1-E-钙粘蛋白依赖途径调节黑色素瘤细胞迁移。此外,SASH1可能通过抑制Shh-Gli1和PI3K-AKT途径抑制肝癌细胞的侵袭和转移。YAP是Hippo/YAP信号通路下游的转录共激活因子,其活化及表达水平受多种因素调控。Hippo/YAP信号通路被激活后,其核心激酶MST1/2-LATS1/2通过磷酸化YAP/TAZ,使其经过蛋白酶体途径降解,进而发挥抑癌作用。肌动蛋白聚合与解聚可调控YAP在肿瘤细胞中的核定位,故F-肌动蛋白与Hippo/YAP通路的交联是调控乳腺癌转移能力的重要手段。本研究通过探讨SASH1调控三阴性乳腺癌细胞侵袭的分子机制,为临床靶向治疗三阴性乳腺癌提供新的依据。方法:1.免疫组化实验分析68例非三阴性乳腺癌和75例三阴性乳腺癌组织芯片中SASH1蛋白的表达水平,并进行统计学分析,明确SASH1表达与三阴性乳腺癌患者临床病理特征的相关性。免疫组化实验分析8例非三阴性乳腺癌组织切片和12例三阴性乳腺癌组织切片SASH1蛋白的表达。2.构建稳定敲低SASH1的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468和BT549,免疫印迹验证其敲低效率。3.Transwell和失巢凋亡实验检测稳定敲低或腺病毒过表达SASH1对三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的影响4.鸡胚肿瘤侵袭模型和尾静脉注射肺转移裸鼠模型检测稳定敲低SASH1对三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的影响。5.转录组测序技术对稳定敲低SASH1和对照的MDA-MB-468进行全基因组测序,比较两者的信号通路和基因表达差异,并采用实时定量聚合酶链式反应进行验证。6.免疫印迹检测SASH1,肌动蛋白以及Hippo/YAP通路相关蛋白表达。7.免疫共沉淀检测SASH1与Hippo/YAP通路相关蛋白相互作用。8.免疫荧光检测SASH1与肌动蛋白共定位,肌动蛋白丝状纤维形成情况,YAP核定位情况。9.磷酸化胶实验检测辐射状态下,LATS1/2对SASH1蛋白的磷酸化。10.分子克隆实验构建SASH1野生型和突变体质粒。结果:1.SASH1与三阴性乳腺癌相关性分析1.1生物信息学结果显示,SASH1在乳腺癌中低表达,且SASH1在三阴性乳腺癌患者中的表达显著低于非三阴性乳腺癌患者。免疫组化分析8例非三阴性乳腺癌和12例三阴性乳腺癌,SASH1在三阴性乳腺癌中表达更低。1.2对68例非三阴性乳腺癌和75例三阴性乳腺癌进行免疫组化分析,细胞质中的表达显示,非三阴性乳腺癌中的SASH1低表达患者比例为43.1%（28/43）,而在三阴性乳腺癌细胞中低表达患者比例为60.8%（45/74）,两者差异显著（p=0.037）。同时,细胞膜中的表达显示,在非三阴性乳腺癌中的SASH1低表达患者比例为12.3%（8/65）,而在三阴性乳腺癌细胞中低表达患者比例为28.7%（21/73）,两者差异显著（p=0.018）,提示SASH1在三阴性乳腺癌组织中表达量显著低于非三阴性乳腺癌组织。而且临床相关性分析结果显示,SASH1的表达水平与乳腺癌分子分型密切相关。但是,与患者年龄,原发灶浸润（T）,肿瘤分期（TNM）,淋巴细胞转移（N）,p53、E-Cadherin、Ki67表达无关。2.SASH1抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭2.1敲低SASH1促进三阴性乳腺癌细胞（BT549和MDA-MB-468）侵袭。2.2过表达SASH1显著抑制三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MDA-MB-468）侵袭。2.3鸡胚肿瘤侵袭模型和尾静脉注射肺转移裸鼠模型结果证实,敲低SASH1增强三阴性乳腺癌细胞侵袭能力。3.SASH1抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭的分子机制3.1 RNAseq表达谱测序结果显示SASH1与细胞外基质通路密切相关,且敲低SASH1显著上调ARHGAP42基因,并且通过实时定量PCR和免疫印迹实验得到验证。3.2敲低SASH1抑制三阴性乳腺癌细胞F-肌动蛋白丝状纤维形成,促进F-肌动蛋白向G-肌动蛋白转变。3.3敲低SASH1抑制三阴性乳腺癌细胞YAP的磷酸化,促进YAP入核,转录调控CYR61表达增加。3.4腺病毒过表达SASH1可回复敲低SASH1引起的三阴性乳腺癌细胞磷酸化YAP下调和YAP入核增加。3.5 F-肌动蛋白聚合剂Jasplakinolide抑制敲低SASH1介导的三阴性乳腺癌细胞YAP入核。3.6 SASH1调控ARHGAP42的表达,且SASH1抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭依赖于ARHGAP42。3.7 SASH1与MAST1/2以及LATS1/2均存在相互作用,且SASH1调控三阴性乳腺癌细胞侵袭依赖于LATS1。3.8辐射条件下,LATS1/2可磷酸化SASH1蛋白,磷酸化位点为S407。3.9 SASH1抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭依赖于S407位点结论:1.SASH1在乳腺癌患者中低表达,其表达量与预后以及乳腺癌分子分型相关,且SASH1在三阴性乳腺癌患者中表达显著低于非三阴性乳腺癌患者。2.SASH1通过F-肌动蛋白/YAP轴抑制三阴性乳腺癌侵袭。3.SASH1调控三阴性乳腺癌细胞侵袭依赖于ARHGAP42.4.SASH1调控三阴性乳腺癌细胞侵袭依赖于LATS1。5.MST1/2以及LAST1/2与SASH1存在相互作用,且辐射条件下,LATS1/2通过S407位点磷酸化SASH1蛋白。6.SASH1抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭依赖于S407位点