龋齿在大多数国家是主要的口腔问题。根据第三次全国口腔健康调查的结果,我国5岁儿童乳牙龋病的患病率为66.0%,12岁儿童恒牙龋病的患病率为28.9%,35-44岁中年人龋病患病率为88.1%，65-74岁老年人龋病患病率为98.4%(全国牙病防治指导组,2008)。虽然包括食品加氟等预防龋齿的有效方式己在临床中被应用(Hinman, Sterritt et al.1996; Ellwood, Blinkhorn et al.1998),但是对于如何对抗引起感染的的病原体微生物却缺少合适的治疗方法(Gu, Lux et al.2002; Luoma, Murtomaa et al.2009)。这是因为口腔是一个拥有丰富多样微生物群落的复杂的生态系统,对它采取任何干扰措施,都会造成一系列无法预期的连锁反应(Brook1999).因此为了消除口腔病原菌而提出的细菌替代疗法成为研究的新思路。变异链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)被认为是与人类口腔龋齿最密切相关的主要病原体。其在代谢过程中产生的酸性物质,因造成牙面的矿物质溶解,成为其主要致龋毒力因子(Loesche1986)。此外,变异链球菌对牙面的蔗糖依赖性黏附能力帮助细菌不会在咀嚼黏附或唾液冲刷的的过程中被冲洗掉。本次实验中,我们尝试加强低产酸效应菌株的蔗糖黏附能力以增强其与更具致龋性的亲代菌株之间的竞争力,理论上这将最终导致效应菌株在同一个小生境中抢先占据相应的位点(Hillman, Brooks et al.2000)。在本研究中,我们构建出gcrR缺陷的变异链球菌效应株MS-gcrR-def并与野生型UA159比较其形态变化,黏附和产酸能力的差异。根据一系列体外实验和动物致龋实验的结果,说明缺失了整个gcrR基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)的变异株MS-gcrR-def展示出较低的产酸和较强的定植能力,以及较低的致龋能力。本研究分以下三个部分进行：第一部分变异链球菌gcrR缺陷株MS-gcrR-def的构建首先根据Genebank中S. mutans的gcrR基因序列及其上下游同源基因,用Primer5.0设计克隆引物gcrR-For和gcrR-Rev,将其PCR产物插入质粒pMD18-T,形成新的重组质粒pMD-G。根据重组质粒pMD-G的序列在保留gcrR基因翻译起始密码子上游720bp和终止密码子下游705bp同源区的基础上,利用反向PCR方法,为了完全去除gcrR的开放阅读框架,设计反向PCR引物gcrR-rp-For和gcrR-rp-Rev。为了在后续实验中保证与卡那霉素抗性基因的定向连接,在下游引物gcrR-rp-For和上游引物gcrR-rp-Rev的5’端分别加入Clal和Xhol酶切位点。此外以质粒pEGFP-N1为模板,设计克隆引物KanR-For和KanR-Rev,获得卡那抗性片段(KanR,795bp),为了便于在接下来的实验中插入,在上下游引物的5’端插入Clal和Xhol。将反向PCR获得的包含质粒pMD18-T和gcrR上下游的线性片段及通过PCR获得的卡那霉素抗性片段,经Clal和Xho1酶切后实用T4连接酶连接得到重组质粒命名为pMD-GK(4915bp)。以上引物序列送至上海生工合成。为获得相应的PCR产物,在含有Ex Taq DNA聚合酶和Buffer的50μ1混合物中加入相应引物,并放置入PCR仪(ABI),运行以下程序：95℃预变性3min,然后30个循环的95℃变性30s并在合适的温度下退火30s,72℃延伸30s,循环结束后72℃延伸3min。为确认所构建的质粒pMD-GK序列正确,以其为模板,用gcrR-For和gcrR-Rev进行PCR后做1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,见约2.1kb处有一特异条带。以Cla I和Xho I酶切重组质粒pMD-GK后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,放出长约795的卡那抗性片段。以BamHI和Sal I酶切重组质粒后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,放出长2.2kb的片段。将其送至上海生工测序,得到gcrR上下游片段和卡那抗性片段都是正确的。由于pMD18是在大肠杆菌中复制的质粒,在链球菌中通常不能复制,并且同时拥有抗性基因的标记,是-种较为方便取得的自杀载体,可用于同源重组(Ortiz-Martin, Macho et al.2006)。同源重组是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法,因为在该座位有与导入基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换有缺陷的基因片段,达到修改基因的目的(Burr, Burr et al.1988).由于变异链球菌是转化率很低的革兰氏阳性菌,本身的转化效率很低且菌株间转化能力有较大的差异(边专and樊明文1996),所以本实验用感受态刺激肽(Competence stimulating peptide, CSP)诱导变异链球菌UA159,使之较容易摄取外源性DNA,根据本实验室先前的研究(Lau, Sung et al.2002),其转化效率提高了20倍以上。加入感受态刺激肽,如文献所描述的方法将质粒pMD-GK转化入变链UA159,并涂于含1mg/ml卡那霉素的TH平板上(Li, Lau et al.2001)。37℃厌氧过夜培养并从中选择转化株。载体pMD-GK进入细菌内,获得了随机插入变异链球菌基因组的机会。同时由于位于卡那抗性片段两侧的gcrR上下游同源臂的存在,可与染色体上的互补序列结合,并在复制过程中诱导发生染色体上的gcrR基因与质粒上的卡那抗性基因互换。由于抗性基因的标记,最终能在含卡那霉素的琼脂平板上生长的即为成功发生同源重组的转化株。通过微量反应糖管和菌落形态的的观察,可以确认转化子是变异链球菌。提取变异株的染色体DNA并将其作为模板,加入引物P1/P2和RT-gcrRF/RT-gcrRR。扩增应获得包含gcrR上游及KanR内部的拼接片段并应同时缺失gcrR基因片段,通过凝胶电泳观察并回收前者用以测序。根据电泳和测序的结果证实变异株成功敲除了gcrR基因并插入卡那霉素抗性片段。此变异株被命名为MS-gcrR-def。第二部分MS-gcrR-def生化特性和形态方面的研究对比变异链球菌UA159和gcrR缺陷株MS-gcrR-def的黏附,产酸和致龋能力的改变,探讨MS-gcrR-def是否适合作为龋病替代治疗的效应菌株。为了证明其gcrR缺陷对变异链球菌黏附相关基因的影响,在相同的含2%蔗糖的BHI培养基中分别培养变异链球菌UA159和变异株MS-gcrR-def。8000g离心后收集菌体,分别提取其总RNA,加入终浓度为10μg/ml的溶菌酶和20μ g/ml的变溶菌素37℃孵育1h。然后加入Trzol混匀并加入异丙醇沉淀。用70%乙醇清洗沉淀RNA,用无核酸酶水溶解保存。取5μ1RNA溶液加入适量DuRed,2%凝胶电泳观察RNA是否完整并测量其浓度。通过逆转录的方法获得其cDNA,简单来说,提取变链UA159和变异株MS-gcrR-def的总RNA,并按照说明书使用cDNA第一链合成试剂盒(TaKaRa)获得cDNA。Real time PCR,即荧光定量PCR技术,逆转录获得的cDNA,与相应引物一起加入SYBR green预混试剂系统(TaKaRa)。放入7500荧光定量PCR系统(ABI)进行扩增。其循环条件如下：95-C预变性2min,循环40次95℃5s,60℃60s。为了量化gtfD和gbpC基因,以DNA回旋酶亚基A (gyrA)为内参,以确保参与比较的DNA量是一致的。检测出参与表达的gbpC(葡聚糖结合蛋白C)基因与gtfD(葡萄糖基转移酶D)基因的结果说明在变异株MS-gcrR-def中gtfD相对于野生型或补偿株表达增加(MS-gcrR-def平均RQ=3.8497,UA159平均RQ=0.719,补偿株MS-gcrR-def-com平均RQ=1.4487)。同时gbpC的表达在变异株中也大幅增加(MS-gcrR-def平均RQ=19.9497for, UA159平均RQ=0.8317, MS-gcrR-def-com平均RQ=1.0913)。其中变异株gtfD的表达量是野生株的5倍,gbpC的表达量则高达是24倍。对于体外黏附试验,在24孔板中,加入含2%蔗糖的BHI培养基后,1：20接种过夜培养并调整为相同OD值(0D470=1.0)的变链UA159,变异株MS-gcrR-def和补偿株MS-gcrR-def-com菌液,分别培养2h,4h,6h,一式三份,37℃厌氧培养。在指定时间用酶标仪测试其在470nm处的吸光度。去掉浮游细菌和培养基,用蒸馏水清洗三次,室温或温箱干燥后用0.1%结晶紫染色15min。然后再用蒸馏水清洗三次,室温或温箱干燥后,加入30%乙酸溶液,将生物膜上的结晶紫漂洗释放,测定其在562nm处的吸光度。结果表明变异株的黏附能力远远强于野生株,尤其是在早期,这一差异的更显著。野生型和变异株菌液经革兰氏染色,使用光学显微镜观察发现,在含2%蔗糖的BHI培养基中,变异株表现出更多的细菌间的黏附和聚集成团的现象,该结果在早期定植中显得尤其重要。将培养了2h,4h,6h,12h,24h的生物膜样本先用PBS漂洗清除游离细菌,用分子探针SYT09和碘化丙啶染色5min。染色样本在共聚焦显微镜(ZEISS LSM510META)下观察其红绿荧光并用软件Image pro-plus6.0分析。图像表明,变异株能在成膜早期(2h-4h)抢先在Si02上定植并形成生物膜。将变异株与野生型同时1：20接种到含4mlBHI培养基的六孔板中,37℃厌氧培养4h,6h,8h,11h’和24h。用蒸馏水清洗除去游离细菌后,收集附着细菌,提取其总DNA。通过荧光定量技术,分析其中变异株所占比例,结果表明,在同时培养的混合生物膜内变异株达到90%以上。结果说明,在变异株与野生型UA159同时存在的时候,变异株能抢先定植固体表面,并生物膜中限制野生株的生长。为了进一步探讨变异株能否作为合适的替代疗法效应菌,我们同时检测了其产酸能力。在体外产酸试验中,MS-gcrR-def, MS-gcrR-def-com和野生型UA159以1：100的比例接种到含2%蔗糖的BHI培养基中,并在培养前测量其pH值(7.3)。经过16h的培养,pH值再次被分别测量。变异株的终末pH为4.11-4.13,其△pH为3.17-3.19,小于野生型和补偿株的的△pH3.23-3.25,且此差异有统计学意义。此外在生长曲线的观察中我们发现在生长稳定期,变异株的总量少于UA159,说明培养基中累积的酸性物质,对变异株的抑制更为明显。以上结果表明,MS-gcrR-def的黏附性与UA159相比显著增强,产酸能力减少。第三部分MS-gcrR-def在SD大鼠中的致龋能力在喂食三天抗生素后,12只大鼠分为两组。用棉拭子在牙面上接种浓度为2X109CFU/ml的UA159和MS-gcrR-def的菌液。连续三天,都用新鲜菌液接种。接种后,用棉拭子收集牙面的细菌并在MSB板上培养,以确认定植成功。继续向MS-gcrR-def组的大鼠提供含1%菌液的蒸馏水,并一直用致龋饲料2000##喂养。接种过后40天,处死大鼠并取出上下颌骨行龋齿记分。结果显示MS-gcrR-def的致龋能力较野生株降低。