【摘 要】
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目的本文在肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(L02)中鉴定UHRF2的磷酸化修饰差异位点,并探究UHRF2的磷酸化修饰差异位点对其生物学功能的影响。方法本文通过LC-MS-MS技术定量分析U
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目的本文在肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(L02)中鉴定UHRF2的磷酸化修饰差异位点,并探究UHRF2的磷酸化修饰差异位点对其生物学功能的影响。方法本文通过LC-MS-MS技术定量分析UHRF2蛋白在HepG2和L02细胞中的磷酸化修饰差异位点;蛋白免疫印迹技术(WB)检测UHRF2磷酸化位点突变体以及TIP60相关蛋白的表达;流式细胞技术(FCM)检测UHRF2磷酸化位点对细胞周期的影响;免疫荧光技术(IF)验证UHRF2磷酸化位点突变体蛋白的细胞定位;体内泛素化实验检测UHRF2磷酸化位点对其泛素化能力的影响。结果LC-MS-MS结果显示,在HepG2细胞和L02细胞中,UHRF2第643位丝氨酸(S643)和第683位丝氨酸(S683)中的磷酸化修饰水平具有差异;构建UHRF2磷酸化位点突变质粒,并进行DNA测序检测突变质粒的序列;WB检测UHRF2磷酸化位点突变体能够在HepG2细胞和L02细胞中正常表达;FCM检测到在L02细胞中,与WT UHRF2组相比,突变体组中S期细胞显着减少,而G1和G2期的细胞数量显著增加。在HepG2细胞中,与WT UHRF2组相比,UHRF2 S643A和UHRF2 S643A/S683A组中S期细胞显着减少,而UHRF2 S643A/S683A组在G1期和G2期的细胞显着增加;IF实验证明UHRF2的磷酸化位点突变不影响UHRF2在细胞中的亚定位;WB实验检测到UHRF2磷酸化位点突变影响H3K9和H3K14的乙酰化修饰水平;体内泛素化实验检测到UHRF2的磷酸化位点影响自身的泛素化能力。结论在正常肝细胞(L02)和肝癌细胞(HepG2)中,UHRF2存在磷酸化修饰差异位点,UHRF2磷酸化位点不影响其自身的亚定位,但对其泛素化能力,细胞周期,TIP60相关蛋白的表达方面产生影响。
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