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表观遗传学的改变对生物体的基因表达调控起重要作用,而生物体衰老的过程中会伴随着DNA甲基化与去甲基化修饰等表观遗传学的改变。衰老与甲基化修饰两者相互作用影响。而间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）虽然在体外培养增殖能力极强,但在有限次数传代后,MSCs出现增殖抑制等衰老特征,其形态、生物学特征以及表观遗传特征产生了不同程度的变化。细胞增殖抑制的出现以及增殖过程表观遗传学的改变这两个因素都为MSCs的临床应用增加了难度和不确定因素。因此本文希望通过检测MSCs在体外增殖过程中细胞的衰老表现以及DNA甲基化与羟甲基化的变化情况,进而了解MSCs衰老过程中DNA表观遗传学的改变,以及衰老对于其DNA甲基化与羟甲基化的影响,为MSCs“永生化”提供表观遗传学的研究基础。本课题将从人骨髓中分离并提取MSCs进行培养传代。在传代过程中观察其衰老表现,并通过建立超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）检测5-甲基脱氧胞苷（5mdC）与5-羟甲基脱氧胞苷（5hmdC）的方法观察MSCs在体外增殖过程中细胞的全基因组DNA甲基化与羟甲基化的变化情况,为MSCs衰老研究提供表观遗传学调控依据。第一部分人骨髓中分离MSCs传代培养及生物学特性评估目的:本实验通过探索性研究,建立高效简便易操作的MSCs分离培养方法并评价其生物学特性。为MSCs在临床应用中的标准化分离制备提供一个方法参考和实验基础。方法:结合密度梯度离心法与细胞贴壁法并优化其操作步骤,以达到从骨髓中标准化地分离出MSCs并且可以体外培养的目标。通过流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CDl05、CD117,同时诱导细胞向成脂、成骨以及成软骨细胞分化,以评价此方法分离和培养所得的MSCs的质量。结果:（1）通过细胞密度梯度离心法使用Ficoll分离液成功分离单个核细胞,再结合细胞附壁法通过人MSCs完全培养基纯化出人骨髓MSCs,成功在体外传代培养。（2）通过成脂、成骨以及成软骨细胞的诱导分化培养基,成功对P3代细胞进行诱导分化,并通过特异性染色对分化效果进行了验证。（3）流式细胞仪检测MSCs表面标志CD29阳性率为（99.41%±0.15%）、CD44阳性率为（93.82%±3.37%）、CD73阳性率为（98.32%±1.25%）、CD90阳性率为（95.22%±0.35%）、CD105阳性率为（91.78%±1.80%）,而CD34、CD45、CD117只有少量表达,分别（0.23%±0.06%）、（0.13%±0.04%）和（0.25%±0.05%）。结论:人骨髓MSCs可以通过采用Ficoll-Hypaqu分离液对人骨髓进行密度梯度离心提取单个核细胞后经过专属MSCs培养基贴壁筛选培养而获得。此方法提取的MSCs的满足国际细胞治疗协会提出的鉴定标准。第二部分 建立超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）检测全基因组DNA中5-甲基脱氧胞苷（5mdC）与5-羟甲基脱氧胞苷（5hmdC）水平的方法目的:建立超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）检测全基因组DNA中5-甲基脱氧胞苷（5mdC）与5-羟甲基脱氧胞苷（5hmdC）水平的方法,通过改良样本前处理方法与定量方式,使方法学更具可操作性,为观察不同代数的骨髓MSCs甲基化与去甲基化的水平提供技术基础。方法:通过离心柱法提取MSCs中的基因组DNA,并对其进行酶解反应,使DNA降解为单个脱氧核苷。建立UPLC-MS/MS检测5-甲基脱氧胞嘧啶核苷（5mdC）、5-羟甲基脱氧胞嘧啶核苷（5hmdC）和2’-脱氧鸟苷（dG）的方法。通过使用标准的双链DNA来配置标准定标曲线与质控品样本,对其检测方法进行方法学考察。结果:（1）使用QlAamp DNA Mini Kit QIAGEN试剂盒对骨髓生长融合率达80%-90%的25mL培养瓶（MSCs数量约1-2×106）提取DNA,可以获得5μg-10μgDNA。（2）采用Degradase buffer和DNA Degradase对1μg DNA样本进行酶解1小时,即可将DNA降解完全。（3）UPLC-MS/MS检测5-甲基脱氧胞嘧啶核苷（5mdC）、5-羟甲基脱氧胞嘧啶核苷（5hmdC）和2’-脱氧鸟苷（dG）的方法通过了方法学考察。对1μgDNA最低可以检出5.00×10-4的甲基化率和羟甲基化率。日内、日间精密度变异系数CV均≤10%。准确度均在98%-104%之间。线性相关系数大于0.995。室温放置2小时、自动进样器4小时、4℃冰箱放置7天和-20℃冰箱放置30天不影响检测结果。结论:本研究建立的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）基因组DNA甲基化与羟甲基化水平的检测方法具有良好的可操作性、准确度以及精密度,可以为分析骨髓MSCs传代过程甲基化与去甲基化的水平提供技术基础。第三部分MSCs体外增殖过程中的动态衰老变化以及全基因组DNA甲基化与羟甲基化的变化情况目的:观察在体外传代培养的MSCs DNA甲基化和羟甲基化的变化情况,同时监测其衰老过程以及表现,从而了解MSCs衰老过程中DNA甲基化与羟甲基化的变化情况。方法:提取并分离培养10例人骨髓MSCs,并不断对其传代直至细胞的增殖能力消失。运用衰老相关β-半乳糖苷酶染色对第1、3、5、7、9、13代细胞进行染色。收集第1代、第5代以及最后一代细胞的RNA与DNA,比较此三代细胞的Oct4 mRNA表达水平以及全基因组DNA甲基化与羟甲基化水平。对其中三例的第1代与最后一代细胞进行全基因组DNA甲基化测序。结果:（1）通过对第1、3、5、7、9、13代骨髓MSCs进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色,结果发现染色的阳性率依次为2%、11%、35%、72%、86%和94%。β-半乳糖苷酶染色的阳性率逐代增高。（2）第1代、第5代以及最后一代细胞Oct4 mRNA相对表达水平随着细胞的传代不断降低。第1代细胞Oct4 mRNA表达量高于第5代,p<0.05;而最后一代与第5代细胞相比Oct4 mRNA表达量明显降低,p<0.01。（3）10例骨髓MSCs检测甲基化与羟甲基化率结果显示,第1代、第5代以及最后一代细胞的全基因组甲基化率平均值分别为2.52%、1.81%以及1.61%。第1代与最后一代细胞相比,甲基化率明显下降,p<0.05。而全基因组羟甲基化率则没有明显变化。（4）3例骨髓MSCs全基因组甲基化测序结果显示,第1代细胞的所有C位点甲基化率平均值为3.34%,其中CG类型甲基化率平均值为62.13%,CHG类型甲基化率平均值为0.4%,CHH类型甲基化率平均值为0.37%;最后一代细胞的所有C位点甲基化率平均值为2.74%,其中CG类型甲基化率平均值为50.62%,CHG类型甲基化率平均值为0.42%,CHH类型甲基化率平均值为0.39%。最后一代与第1代细胞相比,C位点甲基化率和CG类型甲基化率明显降低（p<0.05）,CHG类和CHH类甲基化率没有统计学差异。结论:骨髓MSCs在体外传代培养的过程中会不断衰老,细胞干性亦不断降低。随着传代次数的增加,骨髓MSCs的全基因组DNA羟甲基化水平无明显改变,而甲基化水平总体呈下降趋势。与测序结果趋势一致,并且测序结果显示甲基化率降低以CG类型为主。本研究首次从全基因组DNA甲基化水平的角度观察了骨髓MSCs体外传代培养过程中表观遗传学的改变,为MSCs的衰老研究提供了表观遗传学的调控依据。