近年来,人类向空间领域的开发竞争日益激烈,2003年我国“神舟”五号载人飞船成功发射,揭开了中国载人航天工程的新篇章。与此同时,人们越来越关注空间飞行给航天员带来的影响。已知的空间环境中,微重力、辐射以及磁场环境对人类的影响最大,而在这些因素当中,微重力的影响最为显著。研究发现,航天员在微重力环境下,会出现“航天飞行性贫血”,主要表现为红细胞数量和血红蛋白减少。这种空间飞行对航天员的不利影响,仍然是长期载人航空探索的主要障碍之一。因此研究“航天飞行性贫血”的发病机制及其救治方法成为当前的热点。空间航天飞行研究和地面模拟微重力实验均表明微重力能抑制造血干/祖细胞的增殖、分化和功能。我们的前期研究发现模拟微重力能抑制脐血CD34+造血干/祖细胞的红系分化。这提示航天飞行时抑制红细胞生成是红细胞数量减少原因之一。　　 目前,人们越来越重视丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在造血分化中的作用。MAPK是一组通过磷酸化级联反应将细胞外信号从细胞膜转导至细胞核的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。MAPK在细胞增殖、分化、迁移和凋亡中具有重要作用。在哺乳动物细胞中已发现和克隆了细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)/应激激活的蛋白激酶(stress activated proteinkinase,SAPK)、p38等三个MAPK亚家族。研究表明ERK和p3g MAPK都参与造血分化的调控。各种造血细胞分化调节因子,如造血细胞因子,白细胞介素和细胞集落刺激因子等都能激活ERK和p38 MAPK。最近有研究发现微重力通过减少ERK1/2的磷酸化和增加p38 MAPK磷酸化,抑制人间充质干细胞的成骨分化。微重力是否通过影响MAPK,来调节红系分化?有关这方面的研究,目前尚未见报道。　　 转录因子能通过调控大量红系相关基因的表达,在mRNA转录水平上高效调节红系分化。红系珠蛋白转录因子1(globin transcription factor1,GATA-1)是一种锌指结构核蛋白,在调节珠蛋白和其他红系基因的转录中具有关键作用。GATA-1(-/-)小鼠在妊娠中期即死于红细胞成熟障碍所致的严重贫血。研究报道,热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)通过阻止caspase-3介导的GATA—1降解,调节红细胞生成。此外GATA-1还能调节多能造血干细胞的分化成熟。因此GATA-1的表达水平对于红系分化具有重要作用。我们前期研究发现模拟微重力能抑制脐血CD34+造血干/祖细胞的GATA-1 mRNA的表达。这表明微重力可能通过影响GATA-1的表达,抑制红系分化。但目前对于微重力抑制GATA-1表达的机制尚不明确。基因表达调控可在复制、转录、转录后、翻译、和翻译后多等级水平上进行,但DNA转录起始调控是基因表达调控的关键控制点。从转录水平上研究微重力对GATA-1表达调控的影响,将有助于阐明微重力抑制造血干细胞红系分化的机制。　　 红细胞生成还由凋亡信号和存活信号共同调节。大量研究表明ERK1/2信号能够促进细胞存活。ERK的抗凋亡机制可能有:①活化转录因子AP-1。②活化Bcl-2家族成员:RAS-RAF-MEK-ERK途径参与了Bcl-2的磷酸化。③活化CDK2、CDK4:CDK2与CDK4是促进细胞进入G1期与S期的关键因子,两者在Raf被激活时均增加。④活化NF-κB:MEK通过受体相互作用蛋白(RIP)参与活化NIK,最后促进NF-κB的活化,可诱导生存基因表达。研究发现,抑制ERK1/2的活性,能诱导CD34+红系祖细胞凋亡,导致分化完全受抑。与ERK1/2不同,细胞损伤刺激通过激活p38 MAPK,诱导细胞凋亡。p38MAPK至少通过以下途径调控凋亡:①增强c-myc表达。②磷酸化p53③参与Fas/FasL介导的凋亡。④激活c-jun和c-fos。⑤诱导bax转位。⑥增强TNF-α表达,活化p8MAPK,诱导凋亡。此外,GATA-1也能通过调节Bcl-xL的表达,抑制猾亡,促进细胞存活。　　 目前,研究微重力对细胞的影响及其机制主要有两种策略,一种是传统的基于单分子研究的方式,另一种是包涵“组学”概念的新方法。传统单分子研究策略,研究问题集中,容易深入,可以比较透彻地回答一个点上的问题,但是若将这个结果放到一个体系层面上,其功能又变得扑朔迷离。而使用“组学”的方法,能从整体上把握,系统地研究和解决问题。在本研究中,我们希望对微重力影响细胞的作用有一个系统观念,并形成持续研究的框架。运用“组学”策略可能更有效和容易描绘出微重力影响细胞的机制。因此我们用蛋白质组学策略研究微重力对细胞的影响。　　 由于蛋白质组学研究具有大规模、高通量、高灵敏度的特点,因此可以有效分析细胞内的整体蛋白质。然而整个细胞或组织的蛋白组成极其复杂,直接对其进行蛋白质组学分析,往往会丢掉很多蛋白质信息,由此衍生出了亚细胞蛋白质组学。亚细胞蛋白质组就是利用蛋白质组学研究技术来分析一种组织或细胞的某一亚细胞结构内的蛋白质组成,它一方面可以降低样品的复杂度,使分析简单化；另一方面可以相对富集相应亚细胞结构的低丰度蛋白,并且可以部分提示蛋白质的定位和功能信息。　　 细胞核是遗传物质的主要存在部位,基因信息在这里存储管理,并根据细胞的生命活动而被转录出来,从而使细胞适应内环境和本身生命周期的改变,是细胞生命活动的控制中心。核内的蛋白质组主要由核骨架蛋白、核膜蛋白、核仁蛋白、参与调节转录过程的蛋白、参与染色体形成的组蛋白和非组蛋白组成,共同参与细胞核内的功能事件,执行细胞核的功能。当细胞受到某种刺激后,信号从胞外传递到胞内,通过改变细胞内已有蛋白质的修饰或结构状态,使这些蛋白质激活或失活,从而做出即刻的反应,也有一部分蛋白质穿梭出入细胞核,共同参与某些基因的表达,以对外界刺激做出长效的反应。因此,通过了解微重力作用下核内蛋白质组的变化,有助于我们了解微重力抑制造血分化的机制。　　 本研究我们用RCCS模拟微重力,研究微重力对K562细胞红系分化的影响及其机制。(1)首先我们用hemin诱导K562细胞,建立红系分化模型,研究微重力对K562细胞红系分化和凋亡的影响。通过western blot检测微重力作用下ERK1/2和p38磷酸化水平变化,运用RT-PCR和western blot检测微重力作用下GATA-1 mRNA和蛋白表达的变化,探讨微重力影响红系分化的机制。(2)接着我们研究微重力影响GATA-1 mRNA表达的机制。我们通过生物信息学分析,找到GATA-1启动子的可能序列,通过分子克隆技术构建了GATA-1启动子报告基因重组质粒pGL3-GATA-1P,通过转染K562细胞检测其转录活性。(3)最后我们运用双向电泳筛选微重力作用下K562细胞核的差异蛋白,用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定,并对差异蛋白的相互作用进行了生物信息学分析。　　 我们的研究发现模拟微重力能抑制hemin诱导的K562细胞红系分化,并诱导细胞凋亡。模拟微重力能抑制ERK1/2磷酸化,促进p38磷酸化,并抑制GATA-1mRNA和蛋白的表达。因此,微重力抑制红系分化可能涉及ERK1/2失活、p38激活和GATA-1表达下降。接着我们成功构建了GATA-1启动子驱动的荧光素酶报告基因载体pGL3-GATA-1P,研究发现模拟微重力作用下pGL3-GATA-1P转录活性下降,进一步证实了模拟微重力能抑制GATA-1的表达,为后续研究提供了基础。此外我们还用双向电泳技术建立了模拟微重力作用下,K562细胞核差异蛋白质组表达谱,找到15个差异蛋白点。用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定,共鉴定出9种蛋白质,其中6种蛋白HSP27、CBX3、CALB1、RPSA、HNRPC和HNRPQ定位于细胞核。用生物信息学预测蛋白质相互作用,发现鉴定出的蛋白PRDX6、HSP27、PRDX3、RPSA和EIF4H之间存在相互作用。这些研究结果有助于阐明微重力抑制造血干细胞红系分化的机制,为“航天飞行性贫血”的救治提供新思路。