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黄瓜花叶病毒(Cucumbe.mosai.virus，CMV)是目前最重要的植物病毒之一，寄主多、分布广、危害性强。CM.2b蛋白在病毒的致病过程中扮演着致病因子、RNA沉默抑制子和病毒长距离移动决定因子的角色。阐明CM.2b蛋白的致病机理对于发展控制CMV新方法和新策略具有重要的理论指导意义。
FRad352b-CMV重组病毒是用Rad35-CMV株系的2b基因精确替换Fny-CMV株系的2b基因构建而成。该重组病毒在多种烟草寄主上均诱导轻花叶症状。本研究发现该病毒在侵染烟草过程中偶尔会发生突变，导致心叶烟出现重花叶症状。将该突变体命名为FRad35Lcu2b-CMV。该突变株经过汁液摩擦转接心叶烟(Nicotiana.glutinosa)两代后，生物学表型趋于稳定，在心叶烟上表现为重花叶、畸形、矮化、甚至顶端叶坏死，在本生烟(Nicotiana.benthamiana)上表现为叶严重卷曲、矮化、甚至植株坏死。Northern杂交分析FRad352b-CMV和FRad35Leu2b-CMV在心叶烟和本生烟寄主中的子代RNA积累量，结果显示：FRad35Leu2b-CMV的子代RNA积累量显著高于FRad352b-CMV。由此可见，FRad35Leu2b-CMV的强致病性与其子代RNA在寄主体内的高积累量有关。
为明确FRad35Leu2b-CMV突变体的致病功能位点，以突变株FRad35Leu2b-CMV的病毒RNA为模板，对其2b基因的RT-PCR产物进行测序。序列分析结果表明：FRad35Leu2b-CMV与FRad352b-CMV仅有一个氨基酸的差异，即FRad352b-CM.2b蛋白的第55位脯氨酸(Pro)突变成亮氨酸(Leu)，这说明FRad35Leu2b-CMV的2b蛋白第55位Leu对2b蛋白行使致病功能具有关键的作用，该发现与本实验室前期对2b蛋白的致病功能位点分析结果相一致。
为寻找2b蛋白Leu55关键氨基酸介导的致病性与抑制转录后基因沉默(Posttranscriptiona.gen.silencing，PTGS)的关系，在已诱导绿色荧光蛋白(GFP)系统沉默的的转GFP本生烟16c上分别接种FRad35Leu2b-CMV和FRad352b-CMV，发现FRad35Leu2b-CMV可以使GFP已发生系统沉默的寄主新叶重现GFP绿色荧光，Northern杂交分析结果也证实FRad35Lcu2b-CMV能够逆转GFP沉默体系，重新表达GFP，而接种FRad352b-CMV的植株并没有出现逆转现象，这说明2b蛋白Leu55在FRad35Leu2b-CMV抑制寄主RNA转录后基因沉默(PTGS)的过程中起关键作用。
基于以上的研究，我们分别构建FRad35Leu2b-CMV和FRad352b-CMV的2b蛋白的农杆菌瞬时表达载体35S-2bLeu和35S-2bPro。通过农杆菌浸润转GFP本生烟16c叶组织分别瞬时表达35S-2bPro和35S-2bLcu。浸润后3天，35S-2bLeu的浸润区出现亮绿斑，而35S-2bPro的浸润区变暗，这说明3S-2bLeu抑制了寄主的局部转录后基因沉默，使GFP在体内顺利表达；而2bPro不能抑制寄主的局部基因沉默。可见，Leu55在2b蛋白抑制基因局部沉默中起重要作用。但是，在浸润后第7天提取浸润区的总RNA，Northern杂交结果显示：在35S-2bPro和35S-2bLeu的浸润区均检测到GF.siRNA(Smal.interferin.RNAs，siRNAs)，并且浸润区的GF.mRNA下降，说明2bLeu虽然在初期对GFP的局部沉默有抑制作用，但随着时间的推移2bLeu不能抑制浸润区的siRNA的产生，从而导致GF.mRNA的降解。另外在研究Leu55对系统沉默影响的过程中，发现在共浸润后第14天，浸润35S-2bPro的转GFP本生烟16c顶端系统叶显红光，显然顶端系统叶的GFP被寄主基因沉默；而浸润35S-2bLeu的转GFP本生烟16c的顶端系统叶依旧显绿光，说明其顶端的系统叶GFP没有被诱导沉默。Northern杂交结果显示：在浸润35S-2bPro的植株顶端系统叶中检测到GF.siRNA，且未检测到GF.mRNA；而在浸润35S-2bLeu的植株顶端系统叶中并未检测到GF.siRNA，且GF.mRNA水平与Mock相当。以上结果说明2bLeu虽然不能完全抑制浸润区siRNA的产生和由此介导的基因沉默，但抑制了浸润区的siRNA向系统叶移动，故而阻止了系统叶GFP的沉默，而2bPro并不能阻止siRNA的系统移动。
综上所述，我们推测2bLeu介导的高致病性是通过阻止siRNA的系统移动，使得病毒更为有效地系统移动和复制积累，导致寄主表现严重的病毒症状。