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哺乳动物的生殖调控是中枢神经系统和内分泌系统共同参与综合作用的结果,生殖的关键主要取决于HPG轴的几种主要激素的合成和释放。RFRP-3是迄今为止发现的唯一一种能够抑制HPG轴的下丘脑神经肽,尽管对它的研究还不是很多,但是在不同物种间,RFRP-3作为一个关键的负向调控因子,在HPG轴功能调控中的作用是毋庸置疑的。然而,RFRP-3的主要作用部位在下丘脑还是垂体尚不明确。miRNA的发现为揭示RFRP-3的调控机制提供了一种新的思路。近年来,众多研究表明miRNA在哺乳动物的生殖调控中发挥了重要作用,广泛参与生物体内多种生理功能的调控。值得注意的是,关于miRNA在不同神经内分泌细胞中所发挥的生理与病理学调节作用的研究尚显不足,尤其是对HPG轴的调节作用。因此,本文以RFRP信号通路为切入点,初次探索了miRNA在生殖调控中所发挥的重要作用,以期为哺乳动物的生殖研究提供新的理论依据。本课题以小鼠下丘脑细胞系GT1-7和垂体细胞系LβT2细胞为研究对象。1)用RFRP-3的类似物RFRP3-8对GT1-7细胞进行处理后通过高通量测序和生物信息学分析筛选出可能与RFRP信号通路调控相关的主要miRNA:miR155及miR429;2)在此基础上,利用双荧光素酶报告及UTR序列截断实验在293T细胞中验证分析这两种miRNA与其靶基因之间的调控关系及具体作用位点;3)在两种细胞中通过超表达和干扰miRNA及相关基因的表达后,利用RT-PCR及WB技术在mRNA与蛋白水平分别验证其对下游基因GnRH、FSH及LH表达的影响。结果发现:1)RFRP3-8处理的GT1-7细胞通过高通量测序后与对照组相比,总共有328个miRNA发生差异表达,上调和下调的数量分别为160和168。其中miR155和miR429这两种miRNA均显著下调,通过生物信息学分析表明这两种miRNA均可靶向调控Npffr1基因的表达,因此推测其可能在RFRP信号通路的生殖调控中发挥了重要作用;2)在293T细胞中,miR155,429均可以作用于Npffr1的3’UTR序列,在其上的作用位点分别位于1430-1436bp(种子序列为:CGUAAU)和1614-1619bp(种子序列为:UCAUA)之间;3)在GT1-7及LβT2细胞中,对这两种miRNA进行超表达后,无论是在转录水平还是翻译水平均显著降低了Npffr1基因的表达,促进了下游基因GnRH、FSH及LH的表达。更为重要的是,这种促进作用可以通过转入Npffr1的超表达载体而被部分抵消,甚至回复到基底水平。同样的,当用miRNA的抑制剂进行处理后促进了Npffr1的表达。综上所述,在GT1-7和LβT2细胞中,miR155和miR429通过靶向下调Npffr1基因的表达从而促进了下游生殖相关基因GnRH、FSH及LH的表达,在RFRP信号通路的生殖调控中发挥了重要作用,为理解miRNA在哺乳动物生殖过程中的调节机制提供了进一步的理论依据。