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目的：制备新生鼠肠道损伤修复模型,给予PTEN抑制剂-phen干预肠道损伤修复过程。通过肠道组织病理切片,按照Nadler评分标准[1]评估肠道病理损伤情况,观察肠道损伤修复过程中不同时间点肠道组织病理改变。通过Real time PCR、Western blot技术,观察损伤修复过程中Lgr5、β-catenin和PTEN mRNA及蛋白的表达及随时间变化情况。初步探索PTEN抑制剂phen在新生鼠肠道损伤修复中的作用。第一部分PTEN抑制剂作用于新生鼠肠道损伤修复模型的组织学变化研究方法：利用缺氧和冷刺激复制新生大鼠肠道损伤修复模型。1日龄新生鼠(清洁级,SD大鼠)随机分为正常对照组(N)、实验对照组(C)及干预组(E)。均由母鼠喂养。正常对照组不给予任何刺激与干预。实验对照组和干预组,每天早8点和晚8点同时给予缺氧(含6%02的N2,30min)及冷刺激(4℃冰箱,20分钟)各1次,连续3天。每天第1次缺氧冷刺激后,干预组另给予phen1.6μmol/kg/d (生理盐水溶解,浓度为0.08μmol/ml)腹腔注射,而实验对照组则给予相同容量生理盐水腹腔注射。制模过程中观察新生鼠对刺激的反应、进食情况及活动状况,观察新生鼠有无腹胀、腹泻及胃潴留,并于实验前和实验后第4天(完成制模后24h)测量体重,比较各组新生鼠体重变化情况。分别于实验最后一次缺氧和冷刺激后24h(1d)、48h(2d)、72h(3d)和120h(5d)脱臼处死新生大鼠5只,标记为N1、N2、N3、N5; C1、C2、C3、C5和E1、E2、E3、E5(各组5只,共60只)。取新生鼠回盲部肠道组织做病理切片,用Nadler评分标准[1]评估肠道损伤与修复情况。结果：1.制模过程中,实验对照组和干预组新生鼠相继出现不同程度的进食减少、活动下降,并伴有不同程度的腹泻、腹胀。2.实验前,正常对照组、实验对照组和干预组新生鼠平均体重分别为7.36±0.10g、7.59±0.19g和7.60±O.11g,三组新生鼠平均体重差异不具有统计学意义,P=0.407；实验后,正常对照组、实验对照组和干预组的平均体重分别为11.17±0.15、10.38±0.31和10.75±0.14g,实验对照组体重明显低于正常对照组,P=0.032,差异具有有统计学意义。干预组平均体重虽低于正常对照组但高于实验对照组,组间差异不具有统计学意义,PEvsN=0.054、PEvsC=0.295。3.标本取材中发现,实验对照组和干预组新生鼠腹腔有不同程度的浑浊,甚至血性渗液,肠管色泽异常,呈节段性水肿充血、斑片状出血或弹性消失,解剖时偶可见到腹腔内有粪便。4. HE染色正常对照组的回盲部绒毛结构完整,排列规则；腺体排列规则、组织结构清楚；固有层血管无扩张,无明显充血及炎性细胞浸润。干预组和实验对照组中可见不同程度的粘膜及粘膜下层充血水肿；固有层炎症细胞浸润；粘膜不同程度的点状、片状坏死脱落；病理评分介于1-3级之间。干预组、实验对照组病理损伤程度明显重于正常对照组,三样本比较的秩和检验差异具有统计学意义,P=0.000,干预组较实验对照组平均病理损伤程度较轻,但无统计学差异,p=0.468。结论：1.6%O2缺氧30min及4℃冷刺激20mmin制备的新生鼠肠道损伤修复模型,外观表现、体重变化及肠道组织病理改变明显,且模型存活时间较长,更有利于组织病理的实验研究。2.模型中病理损伤最重出现于实验后第2、3天,第5天肠道病理损伤程度较第2、3天减轻,反映肠道损伤后自我修复过程。3. PTEN抑制剂干预新生鼠肠道损伤修复过程,可改善其外观表现,体重较病变组增加,病理损伤程度减轻,但不具统计学意义,P=0.468。第二部分PTEN抑制剂影响肠道损伤修复过程中Lgr5、β-catenin和PTEN基因表达的实验研究方法：同第一部分实验方法,复制新生鼠肠道损伤修复模型同时给予PTEN抑制剂--phen干预,分为正常对照组(N)、实验对照组(C)和干预组(E)。分别于最后一次缺氧冷刺激后的24h (1d)、48h(2d)和72h(3d)取回盲部肠道标本(标记为N1、N2、N3;C1、C2、C3; E1、E2、E3,每组5只,共45只)。通过Real-time PCR和Western Blot分子生物学技术,测定肠道组织匀浆中Lgr5、β-catenin和PTEN基因的mRNA及蛋白的表达水平,初步探索PTEN抑制剂在肠道损伤修复过程中的影响作用。结果：1. Lgr5mRNA及蛋白表达水平：C组与E组制模后均较N组升高,且E组更高于C组。Lgr5mRNA表达升高,C1组vs N1组,P=0.031；E1组vs C1组,P=0.032；E2组vsC2组,P=0.005,差异有统计学意义；C2组vs N2组,P=0.264；C3组vs N3组,P=0.146,E3组vs C3组,P=0.081,不具统计学差异。Lgr5蛋白表达升高,C1组vs N1组,P=0.045；E1组vs C1组,P=0.036；差异有统计学意义。C2组vs N2组,P=0.062；C3组vs N3组,P=0.059；E2组vs C2组,P=0.093；E3组vs C3组,P=O.177,不具统计学差异。2. β-catenin mRNA及蛋白表达水平：C组与E组制模后均较N组升高,且E组更高于C组。β-catenin mRNA表达升高,C1组vs N1组,P=0.039；E1组vs C1组,P=0.008；E2组vsC2组,P=0.010,差异有统计学意义；C2组vs N2组,P=0.060；C3组vs N3组,P=0.200,E3组vs C3组,P=0.077,不具统计学差异。p-β-catenin蛋白表达升高,C1组vsN1组,P=0.013；C2组vs N2组,P=0.007；E1组vs C1组,P=0.043；差异有统计学意义；C3组vs N3组,P=0.052；E2组vs C2组,P=0.109；E3组vs C3组,P=0.094,不具统计学差异。3. PTEN mRNA及蛋白表达水平：C组与E组制模后均较N组下降,且E组更低于C组。PTEN mRNA表达下降,C1组vs N1组,P=0.038；E1组vs C1组,P=0.003；E2组vsC2组,P=0.030；E3组vs C3组,P=0.030,差异有统计学意义；C2组vs N2组,P=0.134；C3组vs N3组,P=0.679,不具统计学差异。PTEN蛋白表达下降,C1组vs N1组,P=0.037；E2组vs C2组,P=0.008；E3组vsC3组,P=0.048,差异有统计学意义；C2组vs N2组,P=0.123；C3组vs N3组,P=0.522,E1组vs C1组,P=0.093；不具统计学差异。4. Lgr5与P-catenin mRNA表达水平呈正相关,相关系数r=0.885,P=0.000；Lgr5与PTEN mRNA的表达水平呈负相关,相关系数r=-0.877,P=0.000。Western blot Lgr5、p-β-catenin、PTEN蛋白的表达水平趋势和Real time PCR Lgr5、β-catenin、PTEN mRNA的表达水平和相一致,Lgr5和p-β-catenin蛋白的表达水平呈正相关,相关系数r=0.789,P=0.000;Lgr5和PTEN蛋白平均水平呈负相关,相关系数r=-0.823,P-0.000。5. PTEN蛋白的表达C3组高于C1组,P=0.022,其余Lgr5、β-catenin和PTEN mRNA及蛋白表达水平在各自组内、不同时间点的变化比较均无显著性差异。结论：1.肠道损伤修复期,Lgr5和P-catenin转录与蛋白表达水平升高,与修复期肠道干细胞分化、增殖增加有关。PTEN表达增加可能为机体的负反馈调节机制所致。2. PTEN抑制剂通过下调PTEN mRNA和蛋白表达水平,从而上调Lgr5和P-catenin mRNA和蛋白表达水平,以促进肠道损伤后肠干细胞的分化与增殖,加速肠粘膜损伤后修复。3. PTEN抑制剂在一定程度上可促进肠道损伤后的修复,其可能的机制与PI3K/Akt信号通路活性增强有关。