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背景心脏重构在心力衰竭(heart failure,HF)的发生发展中发挥及其重要的作用。到目前为止,促病理性心脏重构的影响因子和调节机制仍未被完全阐明。既往二十多年的研究表明Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)信号激活能促进病理性心脏重构(包括组织重构和电重构),而靶向TLR4治疗已显示可有效地减轻压力超负荷诱发的心脏组织重构。因此,调控TLR4信号可能是防治病理性心脏重构的新策略。髓样分化蛋白1(myeloid differentiation protein 1,MD1)是TLR4的内源性抑制子,不仅主要表达于免疫细胞,而且在心脏组织中也广泛表达。据我们所知,国内外暂无研究报道MD1是否能调节HF时的心脏组织重构和电重构。目的探讨MD1对主动脉缩窄诱导HF后小鼠左室组织重构和电重构的影响,并阐明其可能的作用机制。方法第一部分:选取因意外事故死亡的正常心脏供者和拟行心脏移植术的DCM患者为研究对象,应用实时定量PCR(qRT-PCR)检测两组患者左室标本中的脑钠肽(BNP)和β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达情况,利用Western Blot检测两组患者左室样本中的MD1表达水平,最后记录所有患者的左室射血分数(ejection fraction,EF)。挑选 8-10 周龄、体重 23.5～27.5g、C57BL/6 背景的野生型(Wildtype,WT)雄鼠作为实验对象,实验组通过主动脉缩窄(aortic banding,AB)术建立压力超负荷诱导的HF模型,对照组施行Sham术。在术后不同时间点,用超声心动图检查小鼠左室内径和室壁厚度以确保HF模型制作成功。在术后4周,行超声心动图检查以确定AB组和假手术组(Sham)小鼠的EF值和左室短轴缩短分数(fractional shortening,FS),利用Western Blot检测两组小鼠左室组织中的MD1表达量。第二部分:选取8-10周龄、体重23.5～27.5g的雄性WT小鼠和MD1基因敲除(MD1-KO)小鼠(以C57BL/6小鼠为背景建立)作为实验对象,实验组利用AB术建立压力超负荷诱导的HF模型,对照组施行Sham术。在术后不同时间点,用超声心动图检查左室内径和室壁厚度以确保HF模型制作成功。在术后4周,运用超声心动图及压力容积关系检查评估小鼠的心功能、左室内径及室壁厚度;计算心重与体重比(heart weight/body weight,HW/BW)、肺重与胫骨长度比(lung weight/tibia length,LW/TL)和心重与胫骨长度比(HW/TL)来评估各组小鼠的HW和LW;对各组小鼠的心脏组织切片行H&E染色以及PSR染色以分别评估左室肌细胞横截面积(cross-sectional area,CSA)以及左室间质胶原含量;运用qRT-PCR检测心肌肥厚标志物(BNP,β-MHC)mRNA表达量的变化;利用胶原酶Ⅱ和Langendorff灌流技术分离小鼠的左室肌细胞并用Ca2+指示剂Fluo-4孵育分离后的心肌细胞,然后用荧光显微镜系统记录及分析各组小鼠左室肌细胞的收缩期钙瞬变、肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)钙容量,用共聚焦显微镜记录各组小鼠左室肌细胞的舒张期钙火花并用软件分析记录到的钙火花;利用Western Blot检测各组小鼠左室样本中相关蛋白的表达及磷酸化水平以探寻可能的分子机制。第三部分:选取8-10周龄、体重23.5～27.5g的雄性WT和MD1-KO小鼠作为实验对象,实验组利用AB术建立压力超负荷诱导的HF模型,对照组施行Sham术。在术后不同时间点,行超声心动图检查以确保AB术引起适当的主动脉狭窄。术后4周时,记录并分析小鼠的体表II导联心电图(ECG);制作Langendorff灌流心脏模型,记录左室前游离壁的MAP,用S1-S1起搏刺激确定APD90和APD交替阈值,用Burst刺激检测室性心动过速(ventricular tachycardia,VT)的诱发率;用胶原酶II和Langendorff灌流技术分离小鼠的左室肌细胞并用Ca2+指示剂Fluo-4孵育分离后的心肌细胞,然后用荧光显微镜系统记录及分析各组小鼠左室肌细胞的舒张期自发性钙波,用共聚焦显微镜记录各组小鼠左室肌细胞的舒张期钙火花并用专业性软件分析记录到的钙火花;用全细胞膜片钳技术记录小鼠左室肌细胞膜上ICa,L的激活和失活曲线,用专业软件分析ICa,L;运用Western Blot检测小鼠左室样本中钾、钙、钠通道蛋白的表达以及主要钙调蛋白的表达和磷酸化。结果第一部分:DCM患者左室组织中的MD1蛋白水平显著低于正常心脏供者左室组织中的MD1蛋白水平;DCM患者与正常心脏供者相比,其左室组织中心肌肥厚标志物(BNP,β-MHC)的mRNA水平升高,而其EF值也降低。与Sham组小鼠相比,AB组小鼠的EF值、FS值及左室组织中MD1蛋白的表达显著降低。第二部分:在Sham术后4周,MD1-KO与WT小鼠之间的心脏表型没有明显差异。在AB术后4周,与同窝WT小鼠比较时,MD1-KO小鼠显示:明显加重的左室肥大,这由MD1-KO组中相对较高或较大的左室肌细胞CSA、HW/BW、HW/TL、LW/TL及BNP和β-MHC的mRNA水平证实;加剧的左室扩张和心功能不全,这由较大的左室舒张/收缩末期内径和左室收缩末压以及较小的射血分数、短轴缩短率和左室压力最大和最小上升速率证明;作为病理性心脏重构主要特征的心肌纤维化也更显著;舒张期和收缩期室间隔厚度以及舒张期和收缩期左室后壁厚度无显著增加。在Sham术后4周,MD1-KO与WT小鼠左室样本中的TLR4信号蛋白(抗辐射蛋白105(RP105)、MD2和TLR4)表达、主要钙调蛋白的表达和磷酸化水平以及CASQ2和钙调磷酸酶A的表达无显著差异。在AB术后4周,与同窝WT小鼠比较时,MD1-KO小鼠显示:TLR4信号被过度激活,因为RP105蛋白表达的减少以及MD2和TLR4蛋白表达的增加更显著;CaMKII信号被过度激活,因为ox-CaMKII水平、CaMKII总蛋白水平、CaMKII蛋白磷酸化水平的升高更明显;SERCA2表达和磷酸化水平的降低更明显,而NCX1和PLN表达的增加更显著;PLN的磷酸化也增加,但未达到统计学显著性差异;RyR2的磷酸化以及CASQ2、钙调磷酸酶A表达的增多更显著。RyR2总蛋白的表达量在4组中无差别。在基线时,WT和MD1-KO小鼠的左室肌细胞显示相似的收缩期Ca2+瞬变,但是MD1-KO组左室肌细胞中由咖啡因诱发的Ca2+瞬变最大幅度比WT组的低;在AB术后4周,MD1-KO小鼠的左室肌细胞表现出:显著减小的Ca2+瞬变最大幅度和SERCA2介导的Ca2+瞬变衰减速率常数与收缩期Ca2+瞬变衰减速率常数百分比,明显增大的咖啡因诱导的Ca2+瞬变衰减速率常数与收缩期Ca2+瞬变衰减速率常数百分比,进一步降低的SRCa2+容量,延长的[Ca2+]i瞬变幅度达峰时间和[Ca2+]i瞬变衰减RT50(P<0.05vs.WT-AB)。SRCa2+释放分数的平均值在所有组别中无显著差别。平均钙火花频率(Ca2+ spark frequency,CaSpF)统计结果显示MD1-KO-Sham组左室肌细胞中的舒张期SR Ca2+渗漏显著多于对应的WT-Sham组;在AB术后4周,WT和MD1-KO组小鼠左室肌细胞中的CaSpF均增加,但前者CaSpF的增加量显著高于后者。第三部分:小鼠体表II导联ECG参数分析结果显示:各组中的PR间期相似;与WT-Sham小鼠比较,MD1-KO-AB小鼠表现出更短的RR间期和更长的QRS间期;与WT-AB小鼠相比,MD1-KO-AB小鼠的QRS间期显著延长;与WT-Sham小鼠相比,WT-AB和MD1-KO-AB小鼠的QTc间期均延长,但是MD1-KO-AB小鼠中QTc的延长显著高于对应的WT-AB小鼠。在基础状态下,WT和MD1-KO心脏显示相似的APD90、APD交替的起搏阈间隔和VT诱发率。在AB术后4周,WT和MD1-KO小鼠的APD90均明显延长,但是MD1-KO小鼠组中APD90的延长明显大于对应的WT小鼠组;在被检测的四组小鼠中,引起APD交替的起搏阈间隔的变化与APD90的变化相似;尽管VT诱发率在MD1-KO和WT小鼠组没有显著性差异(P=0.069),但MD1-KO小鼠组的VT诱发率趋向于高于WT小鼠组的VT 诱发率(90.9%vs.50%)。平均CaSpF统计结果显示MD1-KO-Sham组左室肌细胞中的舒张期SR Ca2+渗漏显著多于对应的WT-Sham组左室肌细胞;在AB术后4周,WT和MD1-KO组左室肌细胞中的CaSpF均增加,但前者CaSpF的增加量显著高于后者。各组小鼠左室肌细胞中钙火花的幅度(F/Fo)无显著差异。在基线时,MD1-KO和WT小鼠左室肌细胞出现自发性钙波的百分比无差别;为期4周的AB引起MD1-KO和WT小鼠左室肌细胞出现自发性钙波的百分比均增加(P<0.05),但前者自发性钙波的发生率显著高于后者。在基础状态时,MD1-KO组中ICa,L的最大密度较WT组中的ICa,L的最大密度明显减小。与Sham组相比,为期4周的AB引起WT和MD1-KO组中ICa,L的最大密度均明显降低,但是MD1-KO组与WT-AB组中ICa,L最大密度降低的程度无显著差异。与WT-Sham组相比,其他三组中ICa,L的失活均显示显著减小的半最大电压(half-maximalpotential,V1/2),Ica,L失活的V1/2在后三组中无显著差异。在Sham术后4周,MD1-KO与WT小鼠左室样本中主要钙调蛋白的表达以及主要钾、钙和钠通道蛋白的表达无显著差异。在AB术后4周,与同窝WT小鼠比较时,MD1-KO 小鼠显示:Cav1.2、Kv4.2 和 Kv4.3、KCNH2、KCNE1 和KCNQ1以及Nav1.5蛋白表达的减少更显著,这些蛋白分别能产生ICa,L、Ito、IKr、IKs和INa电流;SERCA2表达和磷酸化水平的降低更明显,而NCX1和PLN表达的增加更显著;PLN的磷酸化也增加,但未达到统计学显著性差异;RyR2的磷酸化增多更显著。RyR2总蛋白的表达在4组中无差别。结论1.MD1在HF患者和小鼠左室组织中的表达明显降低。2.MD1可通过抑制TLR4信号,进而抑制CaMKII/HDAC、钙调磷酸酶/NFAT和AKT信号通路,从而改善压力超负荷所致衰竭左室的组织重构。同时,MD1通过减轻左室肌细胞内钙稳态失衡从而改善压力超负荷诱导的心功能不全。3.MD1对压力超负荷所致衰竭左室的电重构具有保护作用,此作用与抑制TLR4/CaMKII信号并进而减轻钙调蛋白、钾及钠通道蛋白的表达和或功能异常有关。MD1至少能通过缩短心脏复极时间、增大APD交替阈值、减少舒张期SR Ca2+渗漏来改善左室电生理不稳定性。