【目的】牙周炎是一种累及牙周支持组织的慢性感染性疾病,也是糖尿病的主要并发症之一。在牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）刺激下,牙龈成纤维细胞发生了从氧化磷酸化到糖酵解的代谢重组,糖酵解参与了牙周组织的炎症进展。在高糖条件下,葡萄糖的可利用性大大增加;在P.gingivalis刺激下,高糖条件下的牙周组织糖酵解可能会大大影响牙周组织的炎症反应和细胞死亡过程。细胞焦亡是一种促炎性的可调控的细胞死亡,由炎症小体复合体释出活性的炎性caspase,激活削皮素D（gasdermin D,GSDMD）,在细胞膜上形成孔洞,导致细胞的肿胀崩解和IL-1β/IL-18的大量释放。本实验的目的是研究牙周炎进展过程中,丙酮酸激酶2（pyruvate kinase M2,PKM2）介导的糖酵解对炎症小体及细胞焦亡的调控作用,从而为深入了解糖尿病作用下牙周组织炎症和细胞死亡的机制提供参考。【方法】体外培养hGFs和P.gingivalis。首先用不同糖浓度的DMEM培养基孵育hGFs,使用q PCR和WB检测hGFs中糖酵解关键代谢酶己糖激酶2（hexokinase2,HK2）、PKM1/2、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）及乙酰辅酶A（Acetyl-Co A）的表达情况,明确高糖对hGFs糖酵解的影响;向hGFs中给予P.gingivalis刺激,使用LDH检测不同感染复数（MOI）下P.gingivalis的细胞毒性,选用合适的MOI;然后用高糖和P.gingivalis共同刺激hGFs,用LDH及flow cytometry检测hGFs的死亡率及其死亡方式,用q PCR检测hGFs中NLRP3、GSDMD、caspase-1、白细胞介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）及IL-18的mRNA表达情况,分析是否发生了细胞焦亡;然后采用两种PKM2抑制剂Shikonin和Compound 3k预刺激hGFs,使用CCK-8测定不同药物浓度对hGFs的毒性,选择合适的抑制剂药物浓度;最后向高糖条件下培养的hGFs给予PKM2抑制剂预刺激和P.gingivalis刺激,通过LDH和流式细胞术检测细胞死亡率和死亡方式的变化情况,通过q PCR测定NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-1β及IL-18的mRNA表达变化。【结果】使用高糖（25 mM）刺激hGFs,糖酵解相关代谢酶HK2、PFKFB3、PKM1、PKM2、LDHd及Acetyl-Co A都较低糖（5.5 m M）组显著增加,而8 m M组相较于低糖组变化不显著;在高糖和P.gingivalis共刺激下,HK2、PKM2的mRNA和蛋白表达量都随P.gingivalis感染复数增加而增加,且与高糖刺激有协同效应;高糖条件下,HK2、PKM2的蛋白表达水平随P.gingivalis刺激时间延长而增加。在高糖和P.gingivalis共刺激下,P.gingivalis刺激的MOI越高,刺激时间越长,hGFs的死亡率也越高;在同样的MOI和刺激时间下,高糖组的细胞死亡率显著高于低糖组,且流式细胞术检测显示Annexin V-FITC/PI双阳性的比例显著高于低糖组;NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的表达均随P.gingivalis刺激的MOI增加而增加,且在MOI相同时高糖组的表达显著高于低糖组。这提示我们hGFs的焦亡与细胞周围的细菌浓度和糖浓度有关。采用shikonin和compound 3k抑制PKM2后,显示两种抑制剂均能有效抑制P.gingivalis诱导的hGFs细胞焦亡,并且能显著降低NLRP3、GSDMD和IL-1β的表达,提示我们P.gingivalis诱导的hGFs细胞焦亡可能与糖酵解途径的活性有关,抑制PKM2能够有效抑制细胞焦亡。【结论】高糖和P.gingivalis刺激促进hGFs的糖酵解水平;P.gingivalis刺激可以诱导hGFs发生细胞焦亡,且高糖条件可以增强这种刺激效应;P.gingivalis诱导的hGFs细胞焦亡可能与糖酵解途径的活性有关,抑制PKM2可以减少P.gingivalis诱导的hGFs细胞焦亡的发生,并降低促炎因子IL-1β的表达。