球孢白僵菌BEdy1对白背飞虱的亚致死效应研究及互作转录组分析

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白背飞虱[Sogatella furcifera(Horváth)]是我国及许多亚洲国家水稻生产上的一种重要迁飞性害虫,目前生产上其防治主要依赖化学杀虫剂,而长期大量或不合理使用化学杀虫剂,导致环境污染和抗药性增加等问题日益突出。因此,寻找适宜的替代防治手段十分必要。白僵菌(Beauveria)是研究和应用最广泛的一类昆虫病原真菌,目前生产上多以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)防治鳞翅目害虫。有初步研究表明,球孢白僵菌对白背飞虱有良好的致病力和防效。本文分离鉴定了6株田间采集的白僵菌菌株,并从8株供试球孢白僵菌菌株中筛选出强致病力菌株。在此基础上,研究了球孢白僵菌优势菌株BEdy1对白背飞虱的亚致死效应及其侵染过程。最后,基于转录组测序技术筛选球孢白僵菌菌株BEdy1侵染及致病相关基因和白背飞虱若虫染菌后的免疫及代谢相关基因,以期为进一步开发利用球孢白僵菌BEdy1开展白背飞虱的生物防治提供理论依据。取得了如下结果:(1)利用形态学观察和r DNA-ITS序列测定方法鉴定了6株白僵菌菌株均为球孢白僵菌。8株供试球孢白僵菌菌株中,BEdy1菌株的菌落日均增长量、产孢量及萌发率分别为3.74 mm/d、1.37×10~8孢子/cm~2、96.00%,显著优于其它菌株;BEdy1处理组的半致死时间最短(5.12 d),其累计死亡率和僵虫率最高,分别为77.67%、57.78%;BEdy1致病力复测结果表明,在10~5~10~9孢子/m L浓度下,白背飞虱的累计校正死亡率(10 d)为28.20%~83.54%,且BEdy1对白背飞虱存在明显的时间-剂量效应。菌株筛选结果表明,球孢白僵菌BEdy1培养性状优且对白背飞虱的致病力较强,具有较好的应用前景。(2)采用两性生命表分析方法,研究了球孢白僵菌菌株BEdy1对白背飞虱的亚致死效应。结果表明,球孢白僵菌LC25处理组的卵期、4龄和5龄若虫期、成虫前期、总产卵前期TPOP和平均世代周期T均较对照及LC10处理显著延长,成虫期、雌雄成虫寿命、雌虫产卵天数显著缩短,且雌虫平均产卵量、内禀增长率r、净增殖率R0和周限增长率λ较其它组显著下降。LC10处理的卵期和成虫前期比对照延长,但其种群参数无显著变化。因此,球孢白僵菌BEdy1在LC25条件下对白背飞虱种群增长有抑制作用。(3)利用光学显微镜和扫描电镜技术,探究了球孢白僵菌菌株BEdy1对白背飞虱的侵染过程。球孢白僵菌BEdy1的分生孢子以穿透白背飞虱体壁的方式入侵,12 h附着于虫体腹部、头部复眼等位置。24 h时,孢子萌发为芽管或菌丝,后者会在昆虫体壁横向生长。成功进入体腔后,BEdy1在60 h增殖大量菌丝,并感染白背飞虱肌肉、气管、消化道和神经组织。84 h时,穿出体壁的菌丝时最先堆积在虫体腹部。120h时,菌丝缠绕头部复眼,并在虫尸表面长出新的分生孢子,形成新一轮的侵染循环。因此,显微观察结果证实了球孢白僵菌BEdy1菌株具有较强的侵染能力。(4)通过转录组测序技术,球孢白僵菌处理组与对照组比对获得了1988个显著差异表达的基因。GO注释结果表明,DEGs涉及37种二级功能;KEGG pathway结果显示DEGs能比对到核糖体、柠檬酸循环、酪氨酸代谢等57个代谢通路;此外,类枯草杆菌蛋白酶、细胞色素P450酶、几丁质酶样蛋白等与侵染及致病力相关基因均显著差异表达。白背飞虱处理组与对照组比对获得了140个显著差异表达的基因。GO富集结果表明,DEGs被注释到29种GO二级功能中;KEGG pathway结果表明,DEGs显著富集到12个代谢途径,包括嘌呤代谢、亚油酸代谢、溶酶体等途径;对DEGs注释信息分析发现,白背飞虱免疫应答相关的防御素、神经肽GPCR、丝氨酸蛋白酶及其抑制剂与代谢相关的脂肪酶等基因的表达量变化显著。同时,q RT-PCR结果表明8个差异基因表达趋势与转录组测序结果基本一致。球孢白僵菌与白背飞虱互作相关基因的发现,为后续菌株的基因改良来提高对白背飞虱的致病力奠定了分子基础。
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