拟南芥26S蛋白酶体亚基RPN1a的功能与生化分析

来源 :湖南大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:yizaiyouzhe
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植物要按照一定的时序进行生长发育,需要精确并且及时合成相关功能蛋白质,同时也需要及时将已完成使命的蛋白质进行清除,蛋白质的降解同样至关重要。泛素/26S蛋白酶体通过选择性的降解功能蛋白质,广泛参与激素信号转导、细胞周期调控、胁迫应答等生长发育过程的调节,几乎参与了生命过程中所有环节的调控。26S蛋白酶体(26S proteasome)在植物细胞中广泛存在,是一个巨大的多亚基复合体,属于ATP依赖的蛋白酶,由19S调节颗粒(regulatory particle,RP)和20S核心颗粒(core protease,CP)两部分组成。19S调节颗粒需要ATP提供能量来帮助特异性识别被底物,去除底物的泛素共价键,进行解折叠,并且打开通道指引去折叠多肽转移到20S核心颗粒内进行降解。正是由于19S调节颗粒对底物识别的特异性,使得泛素/26S蛋白酶体可以精细的调控生长发育过程中的各个环节。目前大部分19S调节颗粒亚基具体功能尚不清楚,只有极少数被报道参与胁迫应答反应,且相关分子机制并不十分清楚,对19S调节颗粒各亚基的功能研究对揭示相关分子机制具有重要的意义。本研究中,我们通过以RPN1a为诱饵筛选酵母拟南芥全基因组质粒文库,筛选到ABA(Abscisic acid)信号途径中的关键基因ABI1与RPN1a相互作用,鉴定了RPN1A T-DNA插入突变体植株。通过ABA胁迫处理证明RPN1a参与负调控ABA信号途径;在突变体鉴定过程中观察到,RPN1A T-DNA插入突变体植株叶片表皮毛密度增大,进一步研究发现插入突变体植株叶片和主茎上表皮毛密度增大和分支数增加。本论文对RPN1a在ABA信号途径,以及表皮毛发育调控中的功能进行了研究,具体结果如下:  (1)在Tair数据库中搜索RPN家族成员进行生物信息学分析,发现RPN家族成员呈染色体定位数目不等分布,成员之间氨基酸序列相似度低,基因结构的外显子和内含子数目变化不定不具有保守性,进化关系较远。RPN1a蛋白不含信号肽序列,没有明显的疏水区域,没有跨膜结构域不是膜蛋白。与生物信息学分析结果相对应,由RPN1a自身启动子驱动表达的带有绿色荧光蛋白质标签的RPN1a融合蛋白在细胞中各处表达。  (2)启动子区域的转录调控元件分析发现RPN1a基因含有大量激素相关以及胁迫相关转录调控元件,说明RPN1a可能参与植物胁迫应答。以RPN1a为诱饵筛选拟南芥全基因组质粒文库,筛选到ABI1与RPN1a相互作用。通过酵母双杂交以及双分子荧光互补实验(BiFC)证实RPN1a可与ABI1相互作用,并且通过酵母双杂交实验发现RPN1a全长不能够与PYR1,PYL1,RCAR1,ABI2,HAB1,PP2CA,SnRK2.2,SnRK2.3以及OST1发生相互作用,说明RPN1a可通过与ABI1的相互作用参与ABA信号的调控。  (3)RPN1a的mRNA的表达水平和蛋白质水平均受到ABA抑制,rpn1a突变体具有ABA超敏感表型,在ABA胁迫下萌发以及根的伸长受到抑制、气孔关闭更快,由自身启动子驱动的RPN1a融合蛋白在保卫细胞中的表达比周围细胞更强,且ABA信号途径中关键基因的表达量升高,说明RPN1a参与ABA信号途径的负调控。进一步研究发现ABI5在rpn1a突变体中积累,但是RPN1a不能与ABI5发生直接的相互作用,表明RPN1a通过与ABI1的相互作用影响ABI5蛋白质的丰度来参与ABA信号的调控。  (4)外源性GA(Gibberellic acid)以及CK(Cytokinin)可以诱导拟南芥表皮毛细胞的形成,ZFP6(锌指蛋白质6)通过整合赤霉素和细胞分裂素信号调节表皮毛的起始,由RPN1a自身启动子驱动的RPN1a-GFP蛋白质在处于起始分化阶段以及分支的形成阶段的表皮细胞的细胞核和细胞质中的表达比周围细胞更为强烈,外源添加的GA和6-BA可抑制RPN1a的转录,结合表皮毛细胞的形成和表皮毛细胞分支形成的关键基因的转录水平分析结果说明:RPN1a通过抑制ZFP6基因的表达,调控表皮细胞起始分化;通过调控ZFP6,PYM和KAK基因的表达参与调控表皮毛分支形成。
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