随着生物技术的发展,蛋白多肽药物在现代疾病的预防和治疗中的应用日益广泛。蛋白多肽类药物稳定性差,口服或其它非注射给药途径生物利用度低,目前大部分蛋白多肽类药物采用注射给药;另一方面,由于该类药物在血液中的半衰期很短,注射后很快被清除或降解,因此需要频繁给药,患者顺应性较差。将蛋白多肽类药物制备成缓释注射剂不仅可以减少给药次数,提高患者依从性和治疗效果,同时还可以降低药物的毒副作用,减少总给药剂量,从而减轻病人的经济负担。胸腺五肽是一种临床上广泛应用的双向免疫调节剂,能够选择性诱导和促进T细胞的分化、增殖和成熟,调节T细胞亚群的比例,使CD4~+/CD8~+趋于正常。目前上市的胸腺五肽制剂以冻干粉针剂为主。但有研究证实,胸腺五肽的效能可以通过缓慢输注得到增强,因此开发能够持续释放药物的缓释制剂对于药物效能的发挥也是有利的。制备缓释制剂主要依据两个原理,一是减少溶出(Noyes-Whitney方程),一是减少扩散(Fick第一扩散定律)。根据Noyes-Whitney方程,减少药物的溶出则可以使溶出速度减慢;而降低药物的溶解度,主要基于两种途径,一种是制成不溶性盐和不溶性复合物,另一种是对药物进行结构修饰。本课题两种途径并行,一方面尝试将胸腺五肽直接制成不溶性复合物,另一方面则对胸腺五肽进行了成酯修饰。制备不溶性盐(酯)和不溶性复合物,制备方法比较简单,产品易于实现工业化生产,是一种广泛应用于上市产品的方法。因此,只要可以制备适宜的水不溶性盐(酯)而且其药效确切,未来的药物制剂仍会利用这种相对简单的方法继续生产缓释药物产品。本文首先尝试制备了胸腺五肽与羧甲基纤维素钠的水不溶性复合物。由于胸腺五肽水溶性大,不溶性复合物的生成量较少,收率较低,同时这种不溶性复合物的释放受释放介质离子强度的影响较大,在模拟组织液(Hank’s平衡盐溶液)中释放时间短,仅约6h,不能达到实验目的。为降低胸腺五肽的水溶性和提高其药效,本文采用化学方法对其进行了成酯修饰,得到不同链长的胸腺五肽酯化物。对各种胸腺五肽酯化产物进行了初步药效学研究。结果表明,酯化物的药效比原药有所增强。进而对酯化物的安全性和稳定性进行了考察,从中选择胸腺五肽乙酯作为模型药物,进一步制备不溶性复合物,最终制备出胸腺五肽乙酯的鞣酸盐复合物。这种复合物的油混悬液在体内外均显示出长效缓释作用。1胸腺五肽酯化物的合成、纯化与鉴别本文采用二氯亚砜法以不同链长的脂肪醇与胸腺五肽进行反应,对胸腺五肽末端羧基和侧链羧基同时进行酯化,得到了胸腺五肽的乙酯、丁酯、己酯和十二醇酯。采用重结晶、制备型薄层色谱或中压反相层析等方法对胸腺五肽酯化物进行了分离纯化,采用HPLC-ESI-MS法,辅以核磁共振和紫外光谱法对酯化产物进行了结构确证。2胸腺五肽酯化物的理化性质及稳定性研究胸腺五肽酯化物的理化性质与原药相比,发生较大的改变,脂溶性增大,水溶性明显降低,并且以胸腺五肽乙酯进行的血浆稳定性考察结果显示,其血浆半衰期稍有延长。酯化物的稳定性影响因素研究结果显示,酯化物对光较为敏感,高温、高湿环境对酯化物的稳定性也有一定影响。因此,酯化物应在低温避光干燥处存放。3胸腺五肽酯化物的药效学研究以MTT法考察了胸腺五肽酯化物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,结果表明,胸腺五肽酯化物能够促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,其作用强于胸腺五肽;并且酯化物的活性随脂肪链的延长而增强。另外,在氢化可的松所致大鼠免疫抑制模型上,以血浆SOD酶活力为指标,考察了胸腺五肽乙酯对免疫抑制大鼠SOD酶活力的影响。结果,胸腺五肽乙酯能够明显增强氢化可的松所致免疫抑制大鼠的血浆SOD酶活力,作用也强于胸腺五肽。4胸腺五肽酯化物的初步安全性评价采用小鼠为受试动物,以静脉注射和皮下注射两种给药途径对胸腺五肽乙酯和己酯的急性毒性进行了初步考察。结果表明,酯化物的毒性较胸腺五肽明显增大,静脉给药途径尤其明显,且己酯的毒性大于乙酯。但毒性反应持续时间较短,除急性死亡者外,一般在20 min内都会恢复正常。存活的小鼠在两周的观察期内均没有出现死亡,体重比给药前有所增加。皮下注射给药时胸腺五肽乙酯剂量达170 mg/kg(比静脉大一倍时),仍未见明显毒性反应,因而认为胸腺五肽乙酯皮下注射给药较为安全。在综合考虑药效、毒性和制备工艺的难易程度的基础上,确定胸腺五肽乙酯用于下一步的制剂研究。5胸腺五肽乙酯鞣酸盐的制备与体内外评价胸腺五肽乙酯与鞣酸可以形成稳定的不溶性复合物,该复合物在Hank’s平衡盐溶液中维持了较长的释放时间。大鼠体内药效学实验结果显示,皮下给予胸腺五肽乙酯鞣酸盐油溶液后血浆SOD活力明显增高,并持续约一周,SOD水平与普通制剂有显著性差异。本课题的创新之处在于,将胸腺五肽进行成酯修饰,得到药效增强,脂溶性增加的酯化产物,这些酯化产物目前还未见报道。另外,本课题在制备缓释制剂过程中,将药剂学方法和化学方法相结合,在通过化学修饰方法来实现缓控释方面进行了有益的探索。