【摘 要】
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池蝶蚌是我国重要的淡水养殖珍珠蚌之一,其培育的珍珠粒径大、光泽度好、品相佳。本研究通过探究池蝶蚌染色体核型,对雌蚌和雄蚌全长转录组进行分析,并对五个温度处理下的池蝶蚌性腺进行二代转录组测序,最终得出温度对池蝶蚌性别调控的差异表达基因,为池蝶蚌性别调控机制提供基础,主要研究结果如下:（1）池蝶蚌有38条染色体,染色体实际长度范围在2.60～4.76μm之间,平均长度为3.51μm;19对染色体中有1
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池蝶蚌是我国重要的淡水养殖珍珠蚌之一,其培育的珍珠粒径大、光泽度好、品相佳。本研究通过探究池蝶蚌染色体核型,对雌蚌和雄蚌全长转录组进行分析,并对五个温度处理下的池蝶蚌性腺进行二代转录组测序,最终得出温度对池蝶蚌性别调控的差异表达基因,为池蝶蚌性别调控机制提供基础,主要研究结果如下:（1）池蝶蚌有38条染色体,染色体实际长度范围在2.60～4.76μm之间,平均长度为3.51μm;19对染色体中有13对中部着丝粒染色体、5对亚中部着丝粒染色体以及1对亚端部着丝粒染色体,其核型为2 n=13 m+5 sm+1 st,染色体臂数NF=74;雌蚌和雄蚌染色体形态类似,核型相同,且未见随体及异形性染色体。（2）利用三代SMRT测序技术对雌蚌和雄蚌进行全长转录组测序,雌蚌和雄蚌获得6577042和5900972条序列,通过Iso-seq的标准矫正和二代RNA-seq数据矫正,转录本去冗余后,雌蚌和雄蚌分别获得96867和111520个转录本,平均长度为4095bp和3876bp。最终,共获得201481个性腺转录本,且序列大于1 kpb占99.5%以上,转录本的数目集中在2.5 kbp～4.5 kbp之间。经NT,NR,KOG/COG,Swiss-Prot,KEGG、Pfam和GO等数据库进行比对,85%以上的转录本得到注释,并筛选出大量性别相关基因,如Sox9、Wnt4,Rspo1和Sry等。通过对全长转录本结构分析,预测到191199个CDS;鉴定出SSR 217648个,其中以单核苷酸重复、二核苷酸重复为主;预测出4021个TF,共62种,大分部种类为锌指结构,其中ZF-C2H2最多;发现32931个可信度高的lnc RNA。（3）本研究分别采用15℃、20℃、25℃、30℃和33℃对30月龄的池蝶蚌进行两周的刺激。实验结束后,提取性腺并进行RNA-seq。将RNA-seq数据比对全长转录本后,进行基因表达水平分析,发现雌性在25℃下样本表达水平略低于其他组;通过DEseq2软件分析,获得各温度下雌性和雄性的差异表达的基因分别有6311,3013,6673,6798和5685个,其中在20℃下差异基因数量最少。差异基因聚类分析显示,雌性组内和雄性组内有类似的表达状况,其中15℃和20℃表达情况类似,聚为一支;25℃、30℃和33℃表达情况类似,聚为一支。（4）差异基因GO富集分析表明,25℃开始出现胚胎发育和细胞增殖和分裂相关基因,例如,富集到胚胎的发育调节,Notch信号通路,纺锤体微管和浓缩染色体外着丝粒等条目。KEGG富集显示,25℃时开始生殖细胞内基因表达活跃,富集到Notch信号通路,卵细胞减数分裂和细胞周期等通路;30℃时,富集到孕酮介导的卵母细胞成熟通路。五个温度下的雌雄差异组共同差异表达802个基因,其中319个基因上调,483个基因下调。筛选出性别相关基因,其中鉴定到Fem1、Tra1、Wnt4和Rspo1等4个性别调控基因。q RT-PCR结果表明,在各温度条件下,雌蚌中Wnt4和Rspo1的表达量显著（P<0.01）高于雄蚌,而雄蚌中Fem1和Tra1的表达量显著（P<0.01）高于雌蚌。雄蚌中与雄性相关的Fem1在15℃和20℃时高表达;雌蚌中与雌性相关的Wnt4和Rspo1在25℃到33℃时高表达;雌蚌和雄蚌中与控制雌雄同体相关的Tra1在25℃到33℃时高表达。综上所述,池蝶蚌中没有发现异型性染色体;通过雌蚌和雄蚌全长转录本分析,获得了丰富的基因功能以及基因结构信息;结合差异基因富集分析以及性别相关基因的表达情况,推测25℃以上的温度有利于诱导池蝶蚌向雌性发育。本研究为性别调控机制和分子特征提供了基础的参考,并为池蝶蚌的性别调控和发育提供了一些数据的支持。
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