适配体化纳米基底制备及SERS检测啶虫脒和毒死蜱农残的研究

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农药残留对食品安全构成潜在危险。传统农药残留检测方法通常要样品采集、样品粉碎、提取净化等,操作琐碎,农药检测周期长,导致整个测试过程耗时耗力,对农产品产前、产中、产后的监督工作带来了许多不便,因此,很有必要发展一种高效、便捷的农残检测新方法。表面增强拉曼光谱(SERS)具有敏感性好、选择性高、样品制备简单优势,广泛应用在生物结构、真菌毒素和病毒等领域。本文将SERS与适配体修饰的纳米基底结合,得到较高的灵敏度并实现特异性检测。具体工作内容如下:首先,制备植酸钠(IP6)-Fe3O4@SiO2@Au金磁性纳米颗粒,用IP6-Fe3O4@SiO2@Au金磁性纳米颗粒偶联巯基化啶虫脒适配体,所得的偶联物Ⅰ作为捕获探针Ⅰ。再合成半胱氨酸(Cys)-SiO2@Au金壳性纳米颗粒,以Cys-SiO2@Au金壳性纳米颗粒偶联巯基化毒死蜱适配体的偶联物Ⅱ,作为捕获探针Ⅱ。随后对上述产物进行紫外可见分光光度计、红外光谱、粒径分析及投射电子显微镜(TEM)表征。结果显示,合成出均一性较好,分散较为均匀约45 nm粒径的球型氨基化Fe3O4纳米核,通过SiO2和IP6修饰的Au种子依次包覆纳米核,IP6-Fe3O4@SiO2@Au在水溶液中呈现较好的单分散性,尺寸约65 nm,Au种子在SiO2层呈点缀状排布生长成壳,增强因子为1.25×107,使用寿命21天。紫外可见吸收图谱显示,偶联物Ⅰ中观察到IP6-Fe3O4@SiO2@Au基底544 nm和啶虫脒适配体原液260 nm的特征吸收峰,表明捕获探针Ⅰ制备成功。再制备尺寸约200 nm的氨基化球型SiO2纳米核,通过调控TEOS以1滴/2s的速率加入,能控制SiO2纳米核的形貌和均匀度,呈有序生长。经过Au种子和Cys依次包覆纳米核,Cys-SiO2@Au在水溶液中呈现一定分散性,金壳生长完整,尺寸约210 nm,均一性较好,增强因子为1.02×107,使用寿命28天。紫外可见吸收图谱显示,偶联物Ⅱ中观察到Cys-SiO2@Au基底690 nm和适配体原液246 nm的特征吸收峰,表明捕获探针Ⅱ制备成功。其次,利用制备好的捕获探针Ⅰ用于SERS检测啶虫脒农残,通过单因素实验和Box-Behnken设计优化,获得最优啶虫脒SERS检测条件。啶虫脒SERS效果对捕获探针Ⅰ体积(A)、促凝剂浓度(B)、孵育时间(C)的二次多项回归方程:Y=-9424.86458+88.83750×A+7603.75000×B+56.81979×C-8.25000×AB-0.17937×AC+99.00000×BC-0.21792×A2-45366.66667×B2-0.26604×C2。模型F值为9.96,响应回归模型呈差异性显著(P=0.0105<0.05),失拟项呈现差异不显著(P=0.1065>0.05),模型决策系数R2=0.9472,说明能阐释94.72%响应值的变化,此模型能实现较好的拟合度。各个因素对啶虫脒SERS相对峰强影响的大小排列是:促凝剂浓度(B)>捕获探针Ⅰ体积(A)>孵育时间(C)。确定啶虫脒最佳SERS检测条件为:捕获探针Ⅰ体积170μL、促凝剂浓度0.15 M、孵育时间80min,SERS相对峰强为883,与理论值883.213接近,与模型预测值基本相符。基于最优条件,啶虫脒浓度(4.5-1500 nM)的对数值与SERS相对峰面积(1480-1520 cm-1)呈现良好的线性关系(y=1499.0616x-1546.0905,R2=0.9978),检测限达1.3 nM。接着,进行啶虫脒特异性验证实验,利用捕获探针Ⅰ捕获啶虫脒靶标,信号探针Ⅰ(羧基荧光素(FAM)偶联啶虫脒适配体的偶联物)标记啶虫脒靶标信号,构建一种啶虫脒特异性验证模型,通过空白组、农药组(啶虫脒、马拉硫磷、卡巴呋喃、辛硫磷、阿维菌素、敌百虫、甲基硫菌灵、多菌灵、毒死蜱)做平行对照检测,证明捕获探针Ⅰ具有特异性捕获效果。最后进行灯笼椒样品中啶虫脒的加标回收实验(回收率为93.3%-102.7%),结果证明此方法特异性显著,对啶虫脒农残检测具有可行性。接着,以毒死蜱适配体偶联的Cys-SiO2@Au金壳性纳米颗粒作为捕获探针Ⅱ,探讨基于捕获探针Ⅱ的SERS检测毒死蜱农残的可行性。通过单因素实验和Box-Behnken设计优化,获得最优检测方案。毒死蜱SERS效果对振荡频率(D)、孵育温度(E)、陈化时间(F)和体系pH(G)的二次多项回归方程:Y’=-4492.60417+11.39000×D+4.82500×E+28.98611×F+917.8333×G-0.014000×DE-0.020833×DF-0.15500×DG+1.37500×EF-2.00000×EG-4.50000×FG-0.019567×D2-0.94417×E2-0.59838×F2-64.29167×G2。模型F值为2.97,响应回归模型呈差异性显著(P=0.0252<0.05),失拟项呈现差异不显著(P=0.9901>0.05),模型决策系数R2=0.7483,说明能阐释74.83%响应值的变化,此模型能实现较好的拟合度。各个因素对毒死蜱SERS相对峰强影响的大小顺序为:孵育温度(E)>体系pH(G)>振荡频率(D)>陈化时间(F)。SERS检测毒死蜱最优条件为:振荡频率260 rpm,孵育温度33℃,陈化时间30 min,pH体系6.3。做3次平行实验,SERS检测相对峰强为470,与理论值469.139接近,与模型预测值基本相符。基于最优方案,SERS相对峰面积(765-805 cm-1)与毒死蜱浓度(10-3000nM)的对数值呈现良好的线性关系(Y=276.2172X-94.9788,R2=0.9863),检测限达2.0nM。随后,以羧基四甲基罗丹明(TAMRA)与毒死蜱适配体的偶联物作为信号探针Ⅱ,结合捕获探针Ⅱ,构建了毒死蜱特异性验证实验。最后进行灯笼椒样品加标回收实验(毒死蜱回收率为93.8%-98.9%),结果证明此方法特异性显著和具有较强亲和力,对毒死蜱农残检测具有可行性。
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