论文部分内容阅读
【目的】尿蛋白是加速慢性肾脏病进展的重要驱动因素。白蛋白是尿蛋白的主要成分,可通过多种机制诱导肾小管上皮细胞损伤。线粒体损伤和功能障碍是白蛋白诱导肾小管上皮细胞损伤的重要原因之一。线粒体自噬能选择性地清除功能失调或受损的线粒体,在维持线粒体稳态中具有重要作用。我们前期的研究表明,白蛋白超负荷通过PINK1/Parkin通路增强了近端肾小管上皮细胞中的线粒体自噬,然而增强的线粒体自噬在白蛋白超负荷模型中的具体作用目前仍不清楚。因此,本研究应用Parkin siRNA和Parkin过表达质粒转染的方法对白蛋白超负荷模型中的线粒体自噬进行调控,检测人近端肾小管上皮细胞中线粒体功能、氧化应激水平及细胞损伤的变化,进一步探索PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬在白蛋白超负荷所致近端肾小管上皮细胞损伤中的作用及机制。【方法】（1）研究对象:人近端肾小管上皮细胞（HK-2）。（2）尿白蛋白超负荷模型:用人血清白蛋白（8mg/ml）处理体外培养的HK-2细胞8h。（3）siRNA转染及分组:应用Parkin siRNA转染干预线粒体自噬,设置对照组（Ctrl）、白蛋白组（ALB）、阴性对照siRNA+白蛋白组（scrambled siRNA+ALB）、Parkin siRNA+白蛋白组（Parkin siRNA+ALB）;（4）过表达质粒转染及分组:应用Parkin过表达质粒转染干预线粒体自噬,设置对照组（Ctrl）、白蛋白组（ALB）、空载体质粒+白蛋白组（empty vector+ALB）、Parkin过表达质粒+白蛋白组（Parkin+ALB）。（5）检测指标:荧光探针双染检测各组细胞中线粒体自噬的变化,免疫印迹技术检测各组HK-2细胞Parkin、PINK1、LC3、p62、cleaved-caspase 3及胞质cytochrome-c的表达变化,TUNEL法检测各组细胞凋亡情况,CCK-8检测细胞活力,JC-1染色检测各组细胞线粒体膜电位,DCF-DA免疫荧光技术检测各组细胞内ROS的表达水平,MitoSOXTM Red荧光染色技术检测各组细胞线粒体ROS的表达水平。【结果】（1）Parkin siRNA转染和Parkin过表达质粒转染后白蛋白超负荷模型中线粒体自噬的变化。荧光探针双染的结果显示:与Ctrl组相比,ALB组、scrambled siRNA+ALB组以及empty vector+ALB组线粒体自噬阳性点均明显增多;Parkin siRNA+ALB组线粒体自噬阳性点较scrambled siRNA+ALB组明显减少;Parkin+ALB组线粒体自噬阳性点较empty vector+ALB组进一步增多。免疫印迹结果显示:与Ctrl组相比,ALB组、scrambled siRNA+ALB组以及empty vector+ALB组Parkin、PINK1及LC3-II的表达均明显增多（P<0.05）,p62的表达均明显减少（P<0.05）;与scrambled siRNA+ALB组相比,Parkin siRNA+ALB组Parkin、PINK1及LC3-II的表达均明显减少（P<0.05）,p62的表达则明显增多（P<0.05）;与empty vector+ALB组相比,Parkin+ALB组中Parkin、PINK1及LC3-II的表达均进一步增多（P<0.05）,p62的表达则明显减少（P<0.05）。（2）抑制或增强线粒体自噬对白蛋白超负荷模型细胞线粒体功能的影响。JC-1染色与免疫印迹的结果显示:与Ctrl组相比,ALB组、scrambled siRNA+ALB组以及empty vector+ALB组线粒体膜电位均明显减低,胞浆cytochrome-c蛋白的表达均显著增加,差异均具有统计学意义（P<0.05）;Parkin siRNA+ALB组线粒体膜电位较scrambled siRNA+ALB组进一步减低,胞浆cytochrome-c蛋白的表达增加,差异均具有统计学意义（P<0.05）;Parkin+ALB组线粒体膜电位较empty vector+ALB组明显增高,胞浆cytochrome-c蛋白的表达则显著减少,差异均具有统计学意义（P<0.05）。（3）抑制或增强线粒体自噬对白蛋白超负荷模型中氧化应激的影响。DCF-DA与MitoSOXTM Red荧光染色的结果显示:与Ctrl组相比,ALB组、scrambled siRNA+ALB组以及empty vector+ALB组细胞内ROS及线粒体ROS的表达均明显增多（P<0.05）;Parkin siRNA+ALB组细胞内ROS及线粒体内ROS表达较scrambled siRNA+ALB组均进一步增多（P<0.05）;Parkin+ALB组细胞内ROS及线粒体内ROS表达较empty vector+ALB组均明显减少（P<0.05）。（4）抑制或增强线粒体自噬对白蛋白超负荷所致HK-2细胞损伤的影响。TUNEL、免疫印迹与CCK-8检测的结果显示:与Ctrl组相比,ALB组、scrambled siRNA+ALB组以及empty vector+ALB组细胞凋亡率均显著增高,cleaved-caspase 3蛋白表达均显著增加,细胞活力均明显减弱,差异均具有统计学意义（P<0.05）;Parkin siRNA+ALB组与scrambled siRNA+ALB组相比,在细胞凋亡率及cleaved-caspase 3蛋白表达进一步增加的同时,细胞活力则进一步减弱,差异均具有统计学意义（P<0.05）;而Parkin+ALB组与empty vector+ALB组相比,在细胞凋亡率及cleaved-caspase 3蛋白表达显著减少的同时,细胞活力则明显增强,差异均具有统计学意义（P<0.05）。【结论】PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通过改善线粒体功能,减轻了细胞及线粒体氧化应激反应,在白蛋白超负荷所致肾小管上皮细胞损伤中发挥保护作用。因此,干预线粒体自噬可能是防治尿蛋白致肾小管上皮细胞损伤的重要策略。