电针“内关”预处理对心肌缺血再灌注大鼠p38MAPK信号通路的影响及机制研究

来源 :湖北中医药大学 | 被引量 : 15次 | 上传用户:daxia3301
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目的利用电针的低创伤、易操作和可控性强的优势,结合针灸经典理论“心胸内关谋”,并借助已有的关于内关-心脏相关性的研究基础,观察电针“内关”预处理对心肌缺血再灌注大鼠早期心功能参数、心室重构、心肌梗死情况,血清及心肌相关因子、线粒体呼吸功能的影响,并借用p38MAPK通路阻滞剂SB203580从p38MAPK信号通路的角度分析其作用机制,为临床各型I/R的防治方法提供新的理论探讨和实验基础。方法选用SPF级雄性Wistar大鼠200只,取材前体重180g-220g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为五组:假手术组(Shame operation group,S组)、模型组(Model group,M组)、电针预处理组(electroacupuncture pretreatment group,EA组)、抑制剂预处理组(SB203580 group,SB组)和电针+抑制剂预处理组(electroacupuncture pretreatment+SB203580 group,EA+SB组)。假手术组:常规饲养,捆绑1次/天,共7天,第8天手术过程中,只开胸穿线,不结扎左冠状动脉前降支;模型组:捆绑1次/天,共7天,第8天通过采用推管法行左冠状动脉缺血再灌注术,制备在体心肌缺血再灌注模型;抑制剂预处理组:捆绑1次/天,共7天,第8天将p38MAPK抑制剂SB203580溶于二甲基亚砜成20%溶液,在造模前给予0.3mg/kg皮下注射,后造模过程同模型组;电针预处理组:捆绑1次/天。电针双侧内关穴操作,直刺深度约5mm,采用HANS-200型电针治疗仪,选用连续波,频率2Hz,强度1mA,电针预处理1次/天,通电治疗20min。共7天,后造模过程同模型组;电针+SB203580预处理组:捆绑1次/天,共7天,电针预处理过程同电针预处理组,第8天造模前给予抑制剂SB203580皮下注射,过程同抑制剂预处理组,后造模过程同模型组。复灌即刻,利用生物信号及压力测试系统(BL-Newcentury 410)测定大鼠左心室心功能指标(舒张末期压力、左室收缩期平均压、短轴缩短率和射血分数),后处死大鼠,取血清待检,剪取心脏,称取梗死区重量和全心重量,分别计算心肌梗死区重量和全心重量的比值。ttc染色法分析心肌梗死面积,采用全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)、肌钙蛋白i(ctni),采用比色法检测ros含量,采用黄嘌呤氧化法检测心肌超氧化物歧化酶(sod)活性,硫代巴比妥酸法检测心肌丙二醛(mda)含量,高效液相色谱法计算心肌组织中atp的含量。利用激光共聚焦显微镜、he染色和透射电镜观察大鼠心肌细胞尤其是线粒体的形态变化。结果(1)m组的梗死面积和梗死程度的比值,与s组相比较,均显著升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的梗死面积和梗死程度的比值均较m组有降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组、ea+sb组和sb组之间无显著性差异(p>0.05)。(2)m组的lvedp与s组相比较,显著升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的lvedp均较m组显著降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组、ea+sb组和sb组之间无显著性差异(p>0.05)。m组的lvsp、fs、ef值与s组相比较,显著升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的lvsp、fs、ef值均较m组显著升高,差异有统计学意义(p<0.05),ea组、ea+sb组和sb组之间无显著性差异(p>0.05)。(3)m组的ldh、ck及ctni与s组相比较,显著升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的ldh、ck及ctni均较m组显著降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的ldh、ck与ea+sb组和sb组之间无显著性差异(p>0.05)。ea组和ea+sb组的ctni与sb组比较,有显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。(4)m组的tnf-α、il-1β和il-6与s组相比较,显著升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的tnf-α、il-1β和il-6均较m组显著降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的tnf-α、il-1β和il-6与ea+sb组和sb组比较,显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。m组的il-4和il-10与s组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。sb组、ea组和ea+sb组的il-4和il-10与m组比较,有显著性差异(p<0.05)。各治疗组之间差异性无统计学意义(p>0.05)。(5)m组的icam-1和vcam-1与s组相比较,显著升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的icam-1和vcam-1均较m组显著降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的icam-1和vcam-1明显低于ea+sb组和sb组,差异有统计学意义(p<0.05)。(6)m组的ros和mda与s组相比较,显著升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的ros和mda均较m组显著降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的ros和mda明显低于ea+sb组和sb组,差异有统计学意义(p<0.05)。m组的sod和atp与s组相比较,显著降低(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的sod和atp均较m组显著升高,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的ros和mda明显高于ea+sb组和sb组,差异有统计学意义(p<0.05)。(7)与s组比较,m组、ea组、sb组及ea+sb组大鼠心肌细胞na+-k+-atpase和ca2+-atpase的活性明显下降(p<0.05),ea组、sb组及ea+sb组大鼠心肌细胞na+-k+-atpase和ca2+-atpase的活性较m组明显提高(p<0.05),ea组中na+-k+-atpase和ca2+-atpase的改善明显优于sb组及ea+sb组,差异具有统计学意义(p<0.05)。(8)m组的mkk3/6、p38及p-p38蛋白表达与s组相比较,显著升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的mkk3/6、p38及p-p38蛋白表达均较m组显著降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的mkk3/6、p38及p-p38蛋白表达数值低于ea+sb组和sb组,但差异无统计学意义(p>0.05)。(9)s组正常心肌纤维排列规则,细胞结构完整,细胞核及线粒体形态和数量正常,线粒体嵴清晰,心肌间未见异常。m组心肌肌纤维出现溶解断裂甚至坏死,间质增大,肿胀明显。部分线粒体固缩变小,部分线粒体肿胀、或外膜破损。线粒体嵴不规则、断裂成絮状或缺失。EA组、SB组及EA+SB组肌纤维间隙轻度增宽,坏死灶减轻,心肌细胞轻微肿胀,细胞核及线粒体结构基本完整,小部分线粒体仍存在空泡样病变。结论1.电针“内关”预处理可使I/R模型大鼠心肌梗死面积和梗死程度明显下降,可减轻线粒体肿胀和坏死程度,减轻心肌细胞间炎症因子浸润,病理形态学检测提示电针可显著改善受损心肌组织的病理损害程度。2.电针“内关”预处理可使I/R模型大鼠LVEDP降低,LVSP、FS和EF升高,可降低血清中LDH、CK及cTnI的含量,保护大鼠心肌组织,改善大鼠心功能。3.电针“内关”预处理可以抑制TNF-a、IL-1β、IL-6等炎性因子的表达,增加IL-4和IL-10等抗炎因子的表达,可以下调心肌粘附分子ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达,通过调控炎症反应相关因子保护受损心肌组织。4.电针“内关”预处理可以减少I/R模型大鼠心肌细胞ROS及MDA的含量,提高的ATP含量,激活SOD和ATP酶的活性,改善RCR,通过保护线粒体结构和功能的完整性来减轻I/R中心肌损伤。5.MKK3/6/p38MAPK信号传导通路参与在体I/R模型大鼠的病理过程,I/R中大鼠MKK3/6和p38MAPK表达上调,电针“内关”预处理可以明显抑制I/R中MKK3/6、p38MAPK的蛋白表达,抑制p38MAPK的磷酸化,对心肌细胞p38信号转导通路的调节可能只是电针“内关”预处理保护I/R,发挥其抗心肌缺血的作用机制之一。6.电针组与p38抑制剂组和电针+p38抑制剂组相比较,对I/R大鼠模型相关指标结果的调控上可见明显差异,但p38抑制剂组和电针+p38抑制剂组之间并未出现明显叠加效应,说明电针内关预处理对I/R的保护机制可能是多层次、多途径的综合效应。
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