论文部分内容阅读
视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma, RB)是最常见的婴幼儿眼内恶性肿瘤,全世界发病率大约1：20000,我国每年新病例约有1000人,占全世界每年新病例的20%,而存活率仅为63%,对患儿的视力和生命造成极大的威胁和危害,己成为医患双方共同关注的重点。视网膜母细胞瘤多发生于5岁以前,可单眼或双眼发病,常因患儿瞳孔区发白(白瞳症)或斜视就诊,也有晚期出现视力下降、眼球突出、青光眼等才引起家长注意,此时已到晚期,治疗效果较差。根据分期不同,往往采用手术治疗或保存治疗。目前国际上推荐采用化学减容法治疗取得了良好的效果,是目前RB治疗的新趋势。但由于其不容忽视的毒副作用,众多学者开始探索寻求新的生物治疗方法,基因治疗成为热点。微小RNA (micro-RNA)是一类长度为20-24个核苷酸的非编码单链小分子RNA,广泛分布于组织和细胞中,参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖和分化等生命活动,与多种肿瘤的发生和发展密切相关,其作用靶点可为抑癌基因,可为癌基因。miRNA-145定位于染色体5q32-33,已经在乳腺癌、结肠癌和淋巴癌等相关疾病研究中证实其几乎在所有肿瘤组织中表达下调,能够抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡。但其在视网膜母细胞瘤中的作用及相关机制研究尚未见报道。胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)属于酪氨酸蛋白激酶家族,能够促进细胞增生、转移并抑制细胞凋亡,与肿瘤细胞侵袭、转移、促进新生血管形成等密切相关。有研究证明,其被配体活化后可通过p-Akt的磷酸化激活PI3K/Akt通路促进脉络膜黑色素瘤的侵袭和转移；脉络膜黑色素瘤组织高表达IGF-1R也与其发生转移及预后呈正相关。我们推测其在视网膜母细胞瘤中也可能起到了相似作用,但尚无相关研究证实。本课题首先采用脂质体介导的基因转染技术,观察miRNA-145对视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响；随后采用免疫组化方法研究了临床视网膜母细胞瘤标本中IGF-1R的表达,并通过体外培养的视网膜母细胞瘤细胞细胞系-Y79细胞,对IGF-1R与细胞的增殖和凋亡的关系进行研究,初步探讨了IGF-1R成为视网膜母细胞瘤的治疗新靶点的可能性。最后对miR-145和IGF-1R对人视网膜母细胞瘤细胞的调控机制进行了进一步的探索,为探索治疗视网膜母细胞瘤的新手段提供实验依据。本课题包括以下三部分内容：第一部分Mir-145对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖和凋亡的影响目的：探讨MicroRNA 145(miR-145)对视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖和凋亡的影响。方法：将人视网膜母细胞瘤细胞株Y79分为四组：miR-145干预组、阴性miRNA对照组、空脂质体组、空白对照组。脂质体转染法将miR-145转入Y79细胞；荧光定量PCR检测转染后48h成熟miR-145的表达；CCK-8法检测转染48h后的细胞增殖抑制率；流式细胞术检测细胞周期；Annexin V/PI免疫荧光双染色和流式细胞术检测细胞凋亡。通过单因素方差分析分析比较各组数据。结果：采用脂质体转染方法,成功将miR-145转染至Y79细胞；荧光定量PCR显示：miR-145干预组成熟miR-145表达(79.06±3.45)明显增加,与阴性miRNA对照组(1.06±0.03)、空脂质体组(0.93±0.02)和空白组(1.00±0.02)比较,差异有统计学意义(F=229.853,P<0.05)；miR-145干预组的增殖抑制率(21.64%)明显高于阴性miRNA对照组(2.57%)、空脂质体组(3.97%)(F=34.13,P<0.05)；miR-145抑制Y79细胞周期于G1期(P<0.01)；Annexin V/PI免疫荧光双染色和流式细胞术显示miR-145干预组Annexin V阳性和Annexin V/PI双阳性细胞明显增多,阳性率明显高于其他三组,差异有统计学意义(F=35.434,P<0.05)。结论：miR-145可以抑制视网膜母细胞瘤细胞Y79的增殖,诱导细胞凋亡。第二部分IGF-1R在视网膜母细胞瘤中的表达和作用目的：研究IGF-1R对人视网膜母细胞瘤细胞的增殖和凋亡的影响。方法：免疫组化法检测IGF-1R在人视网膜母细胞瘤组织中的表达。培养人视网膜母细胞瘤细胞Y79后并分为三组：IGF-1R siRNA干预组、阴性siRNA对照组、空白对照组。以脂质体为载体把小干扰RNA (IGF-1R siRNA)导入Y79细胞；Real-Time PCR分析RNA干扰后IGF-1R mRNA的水平；Western blot检测IGF-1R蛋白表达水平；CCK-8法检测转染24h后的细胞增殖抑制率；Annexin V/PI免疫荧光双染色和流式细胞术检测细胞凋亡。通过单因素方差分析分析比较各组数据。结果：免疫组化法证实IGF-1R在人视网膜母细胞瘤细胞中有表达；小干扰RNA (IGF-1R siRNA)靶向阻止IGF-1R基因在Y79细胞中的表达；Real-Time PCR提示：siRNA组(0.426)的IGF-1R mRNA的基因表达明显下降,与阴性对照组(0.983)和空白对照组(1.000)相比,差异有统计学意义(P<0.01); Western blot检测显示siRNA组的IGF-1R蛋白表达水平分别为阴性siRNA对照组的22.4%,空白对照组的24.0%；CCK-8检测细胞提示siRNA组的A值(0.30)低于CSI组(0.40)和NC(0.42),差异有显著差异(P<0.05)。Annexin V/PI双染色结合流式检测细胞凋亡结果显示：siRNA组Annexin V率为28.9%,明显高于阴性对照组(6.4%)和空白对照组(6.6%),差异具有统计学意义(P<0.01)。结论：IGF-1R在人视网膜母细胞瘤细胞中表达,且通过特异性降低IGF-1R蛋白表达,能够抑制Y79细胞的增殖。第三部分 miR-145通过抑制IGF-1R的表达来调控视网膜母细胞瘤细胞的增殖和凋亡目的：研究miR-145调控视网膜母细胞瘤细胞的增殖和凋亡的机制。方法：培养人视网膜母细胞瘤细胞株Y79后,将实验分为三组：实验分为三组：miR-145mimics干预组、阴性miRNA对照组、空白对照组。Real-Time PCR分析IGF-1R的mRNA的水平；Western blot检测IGF-1R蛋白的表达水平。构建pMIR-REPORT-IGF-1R 3’-UTR荧光素酶质粒。荧光素酶活性检测法检测miR-145与IGF-1R3’-UTR之间的相互作用。各组数据的比较采用单因素方差分析。结果：Real-Time PCR结果提示miR-145mimics干预组的IGF-1R mRNA的量明显下降(0.498),与阴性miRNA对照组为(0.951)和空白对照组(1)相比,差异有显著意义(P<0.05)。Western blot检测显示miR-145组的IGF-1R蛋白表达水平明下降,与阴性miRNA对照组为(0.951)和空白对照组(1)相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。荧光素酶活性检测显示miR-145干预组的萤火虫荧光素酶的活性明显降低(P<0.01),提示miR-145与IGF-1R的发生相互作用。结论：miR-145可以通过降低IGF-1R的表达来抑制人网膜母细胞瘤细胞Y79的增殖。