【摘 要】
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除常见的双螺旋结构以外,富含胞嘧啶（cytosine,C）的核酸序列在细胞内可以折叠形成非典型i-motif四链体结构。该结构通过其折叠与打开的结构动力学,在DNA复制、转录以及端粒代谢等生物过程中发挥着重要的作用。由于i-motif结构可以自发折叠,所以研究其解叠机理对于理解其调控的生物学过程显得尤为重要。而在细胞内,i-motif结构的解开可以由特定的蛋白质来完成,如核不均一核糖核蛋白K（hn
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除常见的双螺旋结构以外,富含胞嘧啶（cytosine,C）的核酸序列在细胞内可以折叠形成非典型i-motif四链体结构。该结构通过其折叠与打开的结构动力学,在DNA复制、转录以及端粒代谢等生物过程中发挥着重要的作用。由于i-motif结构可以自发折叠,所以研究其解叠机理对于理解其调控的生物学过程显得尤为重要。而在细胞内,i-motif结构的解开可以由特定的蛋白质来完成,如核不均一核糖核蛋白K（hnRNP K）。hnRNP K是一种聚胞嘧啶结合蛋白,它可以通过解开原癌基因c-MYC启动子核心序列Py25折叠形成的i-motif结构来激活c-MYC转录,但相关分子动力学过程和机理尚不明确。目前主要有三个问题未得到解释:（1）Py25中包含五个胞嘧啶重复区即1、2、3、4、5,然而其主要折叠结构是1234型还是1245型仍有争议;（2）由于技术手段的限制,hnRNP K解叠c-MYC i-motif结构的微观分子动力学机理尚不清楚;（3）已有报道KH（hnRNP K-homology）结构域可以直接结合单链TCCC或CCCC序列以解开i-motif结构。hnRNP K蛋白含有三个KH结构域,即KH1、KH2、KH3,但它们是否都具有打开i-motif的功能以及哪个KH结构域解叠i-motif活性最强尚不清楚。近些年来,单分子技术的发展极大增强了人们实时监测生物大分子间相互作用过程的能力,对于理解生物大分子相互作用的机理有着不可替代的促进作用。因此本研究利用单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术,结合圆二色谱（CD）和荧光光谱等体相手段,对hnRNP K解叠c-MYC i-motif结构的分子机理展开系统的研究。主要研究结果如下:（1）通过CD技术测定发现,Py25及模拟1245型i-motif的Py25（1245）和模拟1234型i-motif的Py25（1234）序列在pH≤5.8的条件下均可折叠形成i-motif结构,并且1245型比1234型在热力学上更加稳定。接下来,通过smFRET技术确认1245型i-motif是c-MYC i-motif的主要折叠结构。（2）通过不同的蛋白纯化策略,完成了对hnRNP K蛋白以及三个KH结构域的表达与纯化。通过体相荧光从整体水平验证hnRNP K可以解叠Py25形成的i-motif结构,并且hnRNP K解叠i-motif结构的效果与蛋白浓度呈正相关。（3）利用smFRET方法,在单分子水平实时监测hnRNP K解叠i-motif结构的反应细节。结果表明hnRNP K通过两个中间状态解叠c-MYC i-motif结构,并且通过底物突变验证这两个中间状态分别为对发夹（opposite hairpin）和邻发夹（neighboring hairpin）结构。（4）随后三个KH结构域分别与i-motif结构进行反应,结果表明三个KH结构域均能解叠i-motif结构,且KH2的活性最强。最后通过凝胶层析测定显示,hnRNP K在溶液中主要是以二聚体状态存在。本论文在单分子水平揭示了hnRNP K解叠c-MYC i-motif结构的反应细节,为人们理解hnRNP K与i-motif相互作用提供了科学依据,也为后续基于i-motif的药物设计提供了参考。
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