论文部分内容阅读
Sepsis(脓毒症)是一种因为感染而导致的一系列病理、生理方面的异常,是导致全世界感染患者致死致残的重要因素,一直是医学界关注的焦点。我们的前期研究证实:(1)0.5MAC异氟醚复合60%氧对脓毒症具有保护效应;(2)通过芯片研究,我们筛选确定了4个脓毒症相关的miRNA:CLP可诱导小鼠外周血白细胞mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p的高表达,给予0.5MAC异氟醚复合60%氧治疗可逆转这4个miRNA的高表达。但这4个miRNA在中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等的表达情况尚不清楚;目前公认的是,巨噬细胞在脓毒症病理生理机制中起关键作用。我们预实验结果表明,LPS刺激可诱导mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p在RAW264.7细胞中的表达显著升高。本研究拟探讨mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p在氧醚复合治疗脓毒症效应机制中的作用,并探讨这些miRNA成为治疗脓毒症新靶点的可能。材料与方法1.miRNA通过NF-κB信号通路参与氧醚复合保护脓毒症效应(1)细胞实验:将RAW264.7巨噬细胞,随机分为10组:Vehicle组、LPS组、Vehicle+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-542-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、LPS+LV-/mimic-/antigomo-mi R-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy组和LPS+LV-/mimic-/antigomo-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy组。用携带LV3-mmu-mi R-133a-3p、LV3-mmu-mi R-141-3p、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p和LV3-mmu-mi R-542-3p质粒的慢病毒感染RAW264.7细胞72 h后,或者转染mi R-133a-3p mimic/antigomo、mi R-141-3p mimic/antigomo、mi R-3074-2-3p mimic/antigomo和mi R-542-3p mimic/antigomo于RAW264.7细胞12 h后,给予细胞100ng/ml LPS刺激至少2小时建立细胞脓毒症模型。氧醚治疗:给予LPS刺激后即刻将细胞置于0.5MAC异氟醚复合60%氧气环境处理2 h。收集细胞培养上清液检测炎症因子TNF-α和IL-1β水平;免疫印迹法检测细胞核蛋白、细胞浆蛋白p65表达情况和全蛋白p-p65、p65表达情况。(2)动物实验:将雄性昆明小鼠随机分为9组:Sham+Air组、CLP+Air组、CLP+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-NC+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-mi R-133a-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-mi R-141-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-mi R-3074-2-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组、CLP+LV-mi R-542-3p+0.5MAC ISO+60%Oxy组和CLP+LV-mi R-mix+0.5MAC ISO+60%Oxy组。给小鼠尾静脉注射携带LV3-mmu-mi R-133a-3p、LV3-mmumi R-141-3p、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p和LV3-mmu-mi R-542-3p质粒的慢病毒,48 h后建立CLP脓毒症模型。氧醚治疗:造模后1、6小时分别吸入1小时的氧醚复合气体,对照组在相同时间内吸入空气。记录动物7天存活率。2.抑制miRNA表达对脓毒症的保护效应研究(1)动物实验:将雄性昆明小鼠随机分为8组:Sham组、CLP组、CLP+LV-NC inhibitor/antigomo-NC组、CLP+LV-mi R-133a-3p inhibitor/antigomo-mi R-133a-3p组、CLP+LV-mi R-141-3p inhibitor/antigomo-mi R-141-3p组、CLP+LV-mi R-3074-2-3p inhibitor/antigomo-mi R-3074-2-3p组、CLP+LV-mi R-542-3p inhibitor/antigomomi R-542-3p组和CLP+LV-mi R-mix inhibitor/antigomo-mi R-mix组。给小鼠尾静脉注射LV3-mmu-mi R-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-141-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-3074-2-3p-inhibitor或LV3-mmu-mi R-542-3p-inhibitor质粒的慢病毒,48 h后建立CLP脓毒症模型。尾静脉注射miRNA antigomo时间:CLP前48 h或CLP后24 h。记录动物7天存活率。(2)细胞实验:将RAW264.7巨噬细胞,随机分为8组:Vehicle组、LPS组、LPS+LV-NC inhibitor/antigomo-NC组、LPS+LV-mi R-133a-3p inhibitor/antigomomi R-133a-3p组、LPS+LV-mi R-141-3p inhibitor/antigomo-mi R-141-3p组、LPS+LVmi R-3074-2-3p inhibitor/antigomo-mi R-3074-2-3p组、LPS+LV-mi R-542-3p inhibitor/antigomo-mi R-542-3p组和LPS+LV-mi R-mix inhibitor/antigomo-mi R-mix组。用携带LV3-mmu-mi R-133a-3p-inhibitor、LV3-mmu-mi R-141-3p-inhibitor、LV3-mmumi R-3074-2-3p-inhibitor或LV3-mmu-mi R-542-3p-inhibitor质粒的慢病毒感染RAW264.7细胞72 h,或者转染mi R-133a-3p antigomo、mi R-141-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo和mi R-542-3p antigomo于RAW264.7细胞12 h后,给予细胞100 ng/ml LPS刺激2小时建立细胞脓毒症模型。收集细胞培养上清液检测炎症因子TNF-α、IL-1β水平。结果1.本研究中,我们观察到,LPS刺激后,RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-1β显著增多(P<0.05);给予氧醚复合干预可显著抑制LPS刺激所致细胞炎症因子释放的增加(P<0.05)。高表达mi R-133a-3p及mi R-3074-2-3p可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放TNF-α增加的抑制效应(P<0.05);高表达mi R-542-3p可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应(P<0.05)。给予mi R-133a-3p mimic、mi R-3074-2-3p mimic及同时给予上述4个miRNA mimic可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放TNF-α增加的抑制效应(P<0.05);给予mi R-542-3p mimic及同时给予上述4个miRNA mimic可显著逆转氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应(P<0.05)。给予mi R-133a-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著增强氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放TNF-α增加的抑制效应(P<0.05);给予mi R-542-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo均可显著增强氧醚复合对LPS刺激所致细胞释放IL-1β增加的抑制效应(P<0.05)。LPS刺激可上调RAW264.7细胞p-p65表达增加,细胞核p65表达增加,细胞浆p65表达减少,提示:LPS刺激后细胞内NF-κB信号通路被激活。给予氧醚复合干预可抑制LPS诱导的NF-κB信号通路激活;预先高表达上述4个miRNA可部分逆转氧醚复合干预对LPS刺激后NF-κB信号通路激活的抑制效应。动物实验:与假手术组相比,CLP组小鼠存活率显著下降(P<0.05),给予氧醚复合可显著提高CLP动物的存活率(P<0.05);高表达mi R-141-3p及同时高表达上述4个miRNA可显著减弱氧醚复合提高CLP小鼠存活率的效应(P<0.05)。2.我们观察到,分别给予mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p和mi R-542-3p inhibitor可提高CLP小鼠的存活率,但没有统计学差异;而同时给予上述4个miRNA inhibitor可显著提高CLP小鼠的存活率(P<0.05)。此外,造模前同时给予上述4个miRNA antigomo可显著提高CLP小鼠的存活率(P<0.05);造模后分别或同时给予上述4个miRNA antigomo也可提高CLP小鼠的存活率,但没有统计学差异。给予mi R-133a-3p inhibitor、mi R-3074-2-3p inhibitor及同时给予上述4个miRNA inhibitor可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液TNF-α水平的增高(P<0.05);给予mi R-133a-3p inhibitor、mi R-141-3p inhibitor、mi R-542-3p inhibitor和同时给予上述4个miRNA inhibitor可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液IL-1β水平的增高(P<0.05)。给予mi R-133a-3p antigomo、mi R-3074-2-3p antigomo、mi R-542-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液TNF-α水平的增高(P<0.05);给予mi R-3074-2-3p antigomo及同时给予上述4个miRNA antigomo可显著抑制LPS刺激后细胞培养上清液IL-1β水平的增高(P<0.05)。结论由以上结果可知,(1)miRNA介导的NF-κB炎性通路参与了0.5MAC异氟醚复合60%氧对脓毒症的保护效应;(2)抑制mi R-133a-3p、mi R-141-3p、mi R-3074-2-3p或mi R-542-3p具有抗炎效应,并对CLP所致脓毒症有保护效应,提示这4个miRNA有可能成为治疗脓毒症的新靶点。