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据统计,全球平均每年因感染流感病毒致死的人数约为50万。H5N1型高致病性禽流感病毒能直接感染人并致死亡,给人类健康带来了更大的威胁。流感病毒是一种负链RNA病毒,其RNA基因组通常以螺旋状核糖核蛋白复合物(vRNPs)的形式存在于病毒颗粒中。流感病毒vRNPs的出核是流感病毒复制周期中非常重要的一环,当前研究表明携有富含亮氨酸出核信号的流感病毒非结构蛋白NS2(也被称为出核蛋白NEP)能够引导病毒vRNPs穿过核孔复合物(NPC),完成细胞核向细胞质的定向转运。穿过NPC的过程涉及到病毒蛋白与NPC蛋白的相互作用,然而具体的参与蛋白尚不甚清楚。基于此,本研究以病毒NS2蛋白为诱饵,通过酵母双杂交筛选人cDNA文库,筛选了一个NS2新的互作蛋白-NPC蛋白-人核孔素蛋白98(hNup98)。其后,我们对NS2与hNup98间的相互作用进行了深入的研究,并进一步探讨了hNup98参与NS2介导的流感病毒vRNPs核质转运的机制,旨在为进一步解析流感病毒vRNPs的出核机制以及抗病毒药物的开发提供科学依据。
第一章:以综述的形式描述了流感的暴发与流行,其病原流感病毒的一些生物学特性及流感病毒vRNPs出核的研究进展。
第二章:以流感蛋白NS2为诱饵通过酵母双杂交在人cDNA文库中筛选到与之相互作用的蛋白hNup98。NS2与hNup98的相互作用首先在酵母双杂交和哺乳动物细胞双杂交系统中得到证实。接着通过研究NS2与hNup98蛋白的细胞定位,我们发现hNup98能够将NS2蛋白特异性地招募到细胞核仁,这为两蛋白间的相互作用进一步提供了佐证。
第三章:Mapping实验证实:NS2蛋白的N端区域(氨基酸22-53)和hNup98的甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(GLFG)重复区域对于两个蛋白发生结合起着关键作用。hNup98通过其氨基端GLFG重复序列,而非羧基端将NS2招募至核仁。利用leptomycinB(LMB)-出核受体蛋白hCRM1的专一性抑制剂,我们对NS2-hNup98独特的不依赖于出核信号(NES)的互作模式进行了深入研究,揭示了hCRM1在NS2-hNup98互作中潜在的“桥梁”作用。
第四章:进一步实验发现:病毒感染4小时能明显下调细胞中Nup98蛋白的水平,直到感染后24小时,该蛋白均保持在平稳的低水平状态。接着,通过测定病毒滴度TCID50我们发现过表达hNup98的截短片段hNup981-511能显著抑制H5N1病毒的复制。同时,在稳定高表达GFP-hNup981-511的MDCK细胞系中,病毒vRNPs在感染后5h出现了明显的核滞,与对照组(稳定表达GFP的细胞系)形成了鲜明对比。hNup98作为一种重要的NPC穿梭蛋白,可能为流感病毒转运复合底物NS2-M1-vRNP提供特异性的出核锚点,参与并调控了NS2介导的流感病毒vRNPs的出核过程。
第五章:为了研究其他NPC蛋白在流感病毒vRNPs出核中发挥的重要功能,我们将系列NPC蛋白基因分别克隆于哺乳动物细胞双杂交载体上,利用哺乳动物细胞双杂交系统研究了各NPC蛋白与流感出核蛋白NS2间的相互作用。实验数据显示:NS2蛋白与NPC蛋白间的相互作用是选择性的；不同NPC与NS2间的互作强度亦有明显差异,这为进一步揭示流感病毒vRNPs的出核机制提供了线索。