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[目的]研究从结肠癌干细胞提取的gp96-肽复合物冲击DC细胞联合CIK细胞对同源肿瘤干细胞的杀伤效果以及抗原肽生物质谱分析,为进一步研究打下基础。[内容]本研究分为二个部分:第一部分是通过无血清悬浮培养法富集HT29结肠癌干细胞,将获得的结肠癌干细胞经过裂解液裂解获得细胞总蛋白,然后先经过硫酸铵盐析初步纯化,再经过ConA亲和层析进一步提纯,最后经过DEAE离子交换层析纯化出最终目的蛋白(gp96-肽复合物)。对其鉴定我们选择常规的SDS-PAGE和Western-blot。接着用结肠癌干细胞gp96-肽复合物冲击从外周血中分离出的单个核细胞诱导生成的DC后与同源CIK细胞培养后成熟细胞,即DC-CIK细胞,对同源肿瘤干细胞进行杀伤实验,采用LDH法检测gp96-肽复合物冲击对结肠癌干细胞的杀伤活性,其结果采用统计学方法分析;第二部分是通过第一部分的方法获得的gp96-肽复合物,即HT29细胞中的gp96-肽复合物与HT29微球中的gp96-肽复合物送检质谱分析,比较分析。[方法]1、利用无血清培养基(添加了各种必要的细胞因子)富集结肠癌干细胞,微球规则后胰酶消化进行传代培养。2、富集效果的检测:采用流式细胞仪对处理好的微球中的细胞进行CD133+细胞的检测。3、将提取的细胞总蛋白先经过硫酸铵盐析初步纯化,然后经过ConA柱进一步提纯,最后经过DEAE柱纯化出最终目的蛋白。采用凝胶电泳和蛋白免疫印迹对目的蛋白进行鉴定。从各个纯化步骤获得的蛋白,我们采用BCA法测定。4、从人外周血中提取单个核细胞分别诱导DC细胞和CIK细胞。从结肠癌干细胞提取纯化的gp96-肽复合物,并冲击诱导成功的DC。然后将DC和CIK以1: 5的比例共培养。5、建立实验组和对照组,实验组:结肠癌干细胞gp96-肽复合物冲击的DC-CIK细胞组;对照组:DC-CIK细胞组。6、质谱分析从HT29以及从HT29微球中获得的gp96-肽复合物。[结果]1、将复苏后的HT29细胞接种到无血清培养基中,进行无血清培养,10天左右可形成状态最佳的HT29微球。2、利用流式分析技术分析富集效果:第5代左右的HT29微球细胞中CD133+的比例可达(73.92±2.76),明显高于HT29细胞(30.45 ±4.50)。3、经过凝胶电泳和蛋白免疫印迹鉴定最终的目的蛋白确为gp96-肽复合物。4、实验结果显示无论效靶比是10:1、是20:1、还是40:1,负载结肠癌干细胞gp96的DC-CIK对结肠癌干细胞的杀伤率高于DC-CIK组的杀伤率,P<0.05,差异有统计学意义。5、质谱分析从HT29中以及从HT29微球中获得的gp96-肽复合物鉴定到14个共同包含的蛋白。[结论]1、无血清悬浮培养法可以成功富集HT29结肠癌干细胞。从人外周血中分离出的单个核细胞分别经相应的生长因子诱导培养7d后,DC细胞趋于成熟,CIK细胞也逐渐增多。2、通过盐析、两步经典层析后可以从细胞总蛋白中纯化出gp96-肽复合物。3、gp96-肽复合物冲击后的DC-CIK可以有效的杀伤同源细胞。提示gp96-肽复合物在其中发挥重要作用,这为免疫疗法在肿瘤的治疗打下良好的实验基础。4、测出的结肠癌细胞以及结肠癌干细胞gp96所结合的蛋白确实存在差异,值得进一步探究。