研究背景:癫痫(epilepsy)和抗癫痫药物(Anti-epileptic drug,AEDs)对患儿都可以带来很多不良影响,对于抗癫痫治疗的耐受性,依从性和长期维持都有不利地影响,特别是对认知功能的不良作用。目前研究证实生酮饮食(Ketogenic Diet,KD)对难治性癫痫儿童的治疗有效且耐受性较好,截至目前并没有KD对认知或行为方面的不良影响的相关报道。多个研究提示生酮饮食的抗癫痫作用可能与酮体的神经保护作用有关,因此寻找具有抗氧化性的神经保护化合物不仅能够为癫痫的治疗带来新的思路,同时可以为进一步了解神经保护作用的调控机制打好基础。由于癫痫发作和AEDs对患儿认知都有不利影响,因此我们的临床观察研究侧重于了解生酮饮食对认知功能的保护作用。研究显示,大约78%的酮体是β-羟丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA),但是BHBA抗癫痫的功能和机制尚不不能确认,因此本课题重点探讨了 BHBA对难治性癫痫小鼠模型认知功能的恢复作用,拟在进一步揭示BHBA如何防治癫痫发作发挥神经保护作用。本研究分为两个部分:第一部分通过观察KD(改良Atkins方案)对难治性癫痫患儿治疗前后脑电图和认知功能的变化,进行统计分析,明确改良Atkins饮食方法改善儿童难治性癫痫的临床发作、脑电图和认知功能的作用。第二部分应用Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)实验,对实验癫痫小鼠神经行为和病理学进行检测,测定海马组织中ROS、MDA、SOD和GSH-Px的水平和活性,探讨BHBA对癫痫发作介导的海马氧化应激的神经保护作用。通过Bcl-2及Bax基因蛋白表达检测,观察BHBA对对海马神经细胞凋亡的影响,进一步观察AMPK/PPAR α信号通路在BHBA修复氧化应激损伤从而保护神经系统中的作用。第一部分改良Atkins生酮饮食添加对儿童难治性癫痫的认知功能的影响目的:通过统计分析改良Atkins生酮饮食添加治疗前后认知功能、智力测试量表和脑电波形的变化,研究改良Atkins生酮饮食添加对儿童难治性癫痫临床症状、脑电图癫痫样放电数量、脑电波相对功率以及智力的改善作用,确定改良Atkins饮食添加治疗对于难治性癫痫的疗效。方法:研究对象为2015～2018年儿科就诊的难治性癫痫的患儿,采用随机数字表法随机分组:实验组:32例,均采用抗癫痫药物添加改良的Atkins生酮饮食方案(KD+AEDs)联合治疗方法;对照组:28例,均单独采用抗癫痫药物(AEDs)治疗。收集患者基本资料,包括:年龄、性别以及所服用的AEDs。实验组和对照组分别在治疗前、治疗6个月后进行24小时动态观察脑电图,智力测试(韦氏儿童智力测试法),记录癫痫发作次数。根据临床发作次数的减少情况进行临床治疗效果判定,有无发作间期(生酮治疗后)癫痫样放电评价脑电图,计算脑电监测各个波段(α、β、θ、δ)的相对功率,FIQ划分智力等级。本研究获得了山东大学第二医院医学伦理委员会批准,取得患儿监护人的知情同意并签署知情同意书。数据采用SPSS19.0进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义:符合正态分布的计量资料以(x±s)表示,两组间比较采用成组t检验,治疗前后比较采用配对t检验;非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示;计数资料的分析采用χ2检验;脑电波相对功率改变与韦氏智力测试的相关性采用Pearson相关分析。结果:1.对照组临床治疗总有效率71.42%(20/28),实验组临床治疗总有效率96.87%(31/32),实验组临床总有效率显著高于对照组,差异有统计学意义,P<0.05(χ2=6.405,P=0.011)。2.实验组、对照组脑电图IEDs变化总有效率分别为93.75%(30/32)、78.57%(22/28),实验组脑电图IEDs变化总有效率显著高于对照组,差异有统计学意义,P<0.05(χ2=7.428,P=0.007)。3.对照组与实验组α、β、δ、θ波段相对功率治疗前后的差值对比结果表明,组间差异一律p<0.05。在经过生酮饮食治疗6个月后,对照组相对功率(θ波段)大于实验组,生酮饮食未添加的对照组α、β波段相对功率低于实验组,P<0.05;和治疗前相比,对照组样本病例(生酮饮食未添加)治疗后β波段相对功率更小,P<0.05;和治疗前相比,实验组β波段相对功率治疗后更高,P<0.05。实验组和对照组的两组患儿在治疗6个月之后,和治疗前相比,α波段相对功率值更高,δ波段、0波段相对功率值更低,P<0.05。4.实验组经过6个月生酮饮食添加临床治疗后FIQ、PIQ、VIQ显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.实验组治疗前α、β波段相对功率与FIQ呈正相关。6.实验组治疗前后FIQ差异Δ FIQ与治疗前后α波段相对功率的差异、β波段相对功率的差异(Δ α、Δ β)呈负相关,无统计学意义。结论:1.改良Atkins生酮饮食添加对儿童难治性癫痫显著改善临床症状,可以改善EEG的神经电生理指标(发作间期放电指数和脑电波相对功率),可以改善患儿的认知功能。2.改良Atkins生酮饮食添加治疗儿童难治性癫痫时,EEG背景快活动(α、β波段)和认知功能的改善呈正相关,有相关性。快活动(α、β波段)的变化与认知功能的变化没有相关性。第二部分β-羟丁酸对癫痫小鼠的神经保护作用目的:KD的标志性特征就是脂肪酸氧化产生酮体(Ketone body,KB),而酮体的主要成分是BHBA。本部分通过对癫痫小鼠模型进行神经行为学和神经元海马组织病理学检测,包括Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)和测定海马组织氧化应激反应因子ROS、MDA、SOD、GSH-Px的活性,探讨BHBA对癫痫介导的海马氧化应激的保护机制。研究Bcl-2/Bax蛋白表达对小鼠海马神经细胞凋亡的保护作用,观察探讨BHBA对细胞凋亡的影响。将从AMPK信号通路入手,初步揭示BHBA通过干预AMPK信号通路抑制细胞凋亡介导神经元氧化应激损伤从而发挥保护作用机制,进一步探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)在BHBA处理后的抗惊厥作用中的作用。为临床的治疗和新的药物的研制提供基础理论,为生酮饮食的研究提供线索。方法:实验动物随机分为3组(每组15只):正常组、癫痫组、β-羟丁酸组。癫痫组:采用氯化锂-匹罗卡品建模方法建立癫痫模型;β-羟丁酸组:采用氯化锂-匹罗卡品建模方法建立癫痫模型诱发癫痫后按300 mg/kg/day的剂量给予腹腔注射β-羟丁酸溶液。1.Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM),实验动物进行五天的学习阶段。在此阶段,观察小鼠在水中60 s后能否找到平台。第6天,移除平台。使用摄像机记录鼠标穿过平台的次数和60秒时间内目标象限所用时间的百分比。两次实验间隙,每只小鼠休息至少30分钟。2.获取各组小鼠神经海马组织,通过固定、脱水、包埋制作4-5um石蜡切片进行Nissl和Tunel染色,对小鼠神经元海马组织病进行病理学检测,显微镜下观察染色效果,并拍照。3.检测各组海马组织中ROS和MDA的水平,以及SOD和GSH-Px的活性。4.Western blots 检测各组小鼠脑组织 p-AMPK,AMPK、PPAR α、Bcl-2 及Bax等蛋白的表达。结果:l.Morris水迷宫实验:与对照组小鼠相比,癫痫小鼠在获得阶段的逃逸潜伏期显著增加,在BHBA治疗后这种行为减弱。在第6天的探针试验中,与对照小鼠相比,癫痫小鼠穿过平台的频率更低,在目标象限的时间更短。BHBA治疗显著延长了癫痫小鼠靶区的时间。2.癫痫后Nissl和Tunel染色显示海马神经元明显丢失和凋亡。经BHBA治疗后,海马区内整合神经元增多,凋亡细胞减少。3.BHBA减弱了由癫痫引起的海马中ROS和MDA的过度产生。4.与对照组相比,癫痫小鼠海马组织中SOD和GSH-Px的活性被减弱,并且β-羟丁酸组部分但显著地被给予BHBA增强。5.与对照组相比,Western blots显示癫痫小鼠海马中bcl-2蛋白的下调和Bax蛋白的上调。6.与对照组小鼠相比,癫痫小鼠海马中AMPK磷酸化和PPARα的蛋白表达出现了降低,BHBA治疗后海马中的PPARα明显恢复。结论:1.BHBA改善癫痫介导的空间学习缺陷,改善癫痫所致海马神经损伤,可以预防癫痫介导的海马氧化应激,可以改善癫痫引起的细胞凋亡。2.BHBA可能通过激活AMPK信号通路发挥其保护作用,PPAR α的调节可能参与了 BHBA的抗癫痫作用