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临床上恶性实体瘤的治疗策略主要有两种,一是直接杀伤肿瘤细胞,二是抑制肿瘤组织的血液供应,本课题中将两种抗肿瘤候选药物,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing Iigand, TRAIL)及内源性血管生长抑制因子vasostatin进行融合表达,旨在构建出一种具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管形成的双功能蛋白,将两种肿瘤治疗策略进行结合进而产生更优的抗肿瘤功效。论文工作主要围绕双功能融合蛋白VAS-TRAIL的构建表达、制备与活性研究展开,探索确定了融合蛋白表达与制备的工艺路线,并采用蛋白质工程手段提高了融合蛋白的复性率及生物活性,为VAS-TRAIL融合蛋白运用于抗肿瘤研究与应用奠定了基础。本论文的主要研究内容与结论概括如下：1) VAS-TRAIL融合蛋白的克隆与表达根据两个结构域不同的拼接策略构建了TRAIL-VAS及VAS-TRAIL融合基因,并在大肠杆菌系统中进行了重组表达；筛选和比较了MBP及SUMO融合标签对融合蛋白可溶表达的影响,结果表明只有MBP融合标签可以实现融合蛋白的高效可溶表达,但在酶切去除MBP标签的过程中目的蛋白被降解。由此确定表达不带有标签的TRAIL-VAS及VAS-TRAIL融合蛋白,两种融合蛋白在pET28a(+)/BL21(DE3)系统中以包涵体形式大量表达。2)融合蛋白的体外变复性研究为了确定TRAIL-VAS及VAS-TRAIL的融合蛋白的体外变复性方法,通过一系列的单因素实验,确定了采用8M尿素溶解包涵体,复性缓冲液中添加精氨酸、Zn2+及还原剂β巯基乙醇,然后采用尿素梯度透析进行融合蛋白的体外复性,成功得到了可溶形式的TRAIL-VAS及VAS-TRAIL融合蛋白。对复性后的TRAIL-VAS及VAS-TRAIL融合蛋白进行活性测定,检测了融合蛋白对胰腺癌细胞株SW1990、非小细胞肺癌细胞株NCI-H460及内皮细胞FBHE的杀伤作用,发现TRAIL-VAS蛋白对三种细胞没有明显作用；VAS-TRAIL蛋白对SW1990、NCI-H460细胞具有剂量依赖性的杀伤作用,但对FBHE细胞没有明显的杀伤作用,显示VAS-TRAIL相比TRAIL-VAS是更优的融合蛋白拼接顺序,因此以VAS-TRAIL分子为对象进行进一步研究。3)基于包涵体构象及活性的融合蛋白连接臂选择策略在融合蛋白两个结构域之间插入连接臂可以减轻结构域之间的空间干扰并提高活性,为了实现快速且准确的连接臂筛选,本研究中提出了一种新的融合蛋白连接臂选择策略,研究利用融合蛋白包涵体的构象特性结合包涵体活性测定来预测连接臂对融合蛋白复性及活性的影响。本方法首先将3种较常用的连接臂,柔性连接臂FL ((GGGGS) 3)，刚性连接臂RL ((PAPAP) 3)以及螺旋结构连接臂HL ((EAAAK) 3)，插入到VAS-TRAIL融合蛋白两个结构域之间,分别得到含有不同连接臂的融合蛋白VFT、 VRT及VHT,并重组表达得到融合蛋白包涵体。然后利用ATR-FTIR检测包涵体内部结构并对包涵体进行直接测活,根据包涵体的构象及活性结果预测最佳的连接臂选择。实验表明,与不含有连接臂的VAS-TRAIL融合蛋白VT相比,插入连接臂能够明显提高融合蛋白包涵体中的类天然二级结构含量。插入刚性连接臂的融合蛋白VRT包涵体中含有最高的类天然二级结构含量,且VRT包涵体保留了部分的活性,可以杀伤NCI-H460细胞但对FBHE细胞无明显作用,因此我们预测刚性连接臂(PAPAP) 3是更优的连接臂选择。4)建立三重促溶系统溶解和复性融合蛋白包涵体在基于VAS-TRAIL融合蛋白包涵体含有类天然二级结构的基础上,研究出一种包涵体温和变性方法以进一步提高VAS-TRAIL融合蛋白包涵体的复性收率。该方法利用2M尿素、0.4M精氨酸、pH11.5的缓冲液组成的三重促溶系统进行VRT包涵体的温和溶解和复性。研究表明,更高浓度的尿素可以一定程度提高包涵体的溶解率,但是含有2M尿素的三重促溶溶液能够更有效保留包涵体内已有二级结构特性,且溶解包涵体所得蛋白的纯度较高。复性结果显示,三重促溶系统溶解的VRT包涵体蛋白经尿素梯度透析复性后,复性收率为46%,大大高于用8M尿素溶解的VRT包涵体融合蛋白的0.81%。在此基础上,我们对精氨酸在三重变性剂中的作用进行了研究,通过与添加相同尿素但不含精氨酸的碱性缓冲液的复性结果对比,发现添加精氨酸能更有效保持包涵体内的二级结构,融合蛋白的复性收率(46%)也明显高于不添加精氨酸的碱性包涵体溶解液(22%),表明精氨酸在三重促溶系统溶解和复性融合蛋白包涵体中是不可或缺的。5)基于包涵体构象及活性的融合蛋白连接臂选择策略的验证为了验证上述3)中的连接臂选择策略,我们将上述3)中构建的VAS-TRAIL融合蛋白包涵体经三重促溶系统进行复性并进行活性测定。结果表明,所有带有连接臂的VAS-TRAIL蛋白复性收率(均高于40%)显著高于不含有连接臂的VT融合蛋白(23%)。带有螺旋结构连接臂的VHT蛋白具有最高的复性收率,而复性后的VRT具有最高的活性。根据VRT及VHT融合蛋白的同源模型,显示VRT蛋白的vasostatin结构域对其sTRAIL结构域形成三聚体的干扰小于VHT,因此推测有利于其活性的发挥。以上结果表明,刚性连接臂(PAPAP) 3相较于其他连接臂,能够在提高VAS-TRAIL融合蛋白复性收率的同时获得最佳的活性,此结果验证了我们提出的基于包涵体构象及活性的融合蛋白连接臂选择策略的有效性。该连接臂选择策略不需要事先进行蛋白质的变复性操作,有助于提高易聚集融合蛋白的连接臂筛选通量,加快融合蛋白药物的开发进程。圆二色谱分析表明复性后的VRT融合蛋白富含p折叠结构,且VRT蛋白能形成同源三聚体,说明VRT融合蛋白得到了正确的复性。VRT蛋白能够诱导体外培养的NCI-H460肿瘤细胞及FBHE内皮细胞的凋亡,其对肿瘤细胞的杀伤作用与sTRAIL相当,对内皮细胞的杀伤作用高于单独的sTRAIL及vasostatin,显示出VRT蛋白在抗肿瘤治疗研究与应用中的前景。