牛坏死杆菌（Fusobacterium necrophorum）是革兰氏阴性厌氧多形性细菌,主要引起肝脓肿、腐蹄病和犊牛白喉,并在奶牛乳腺炎、子宫内膜炎的发展中起重要作用。牛坏死杆菌对宿主细胞的黏附作用是其入侵机体及致病的关键步骤,因此,明确43K OMP发挥黏附作用的主要位点及筛选相应抗原表位具有重要意义。本试验从牛坏死杆菌43K OMP与宿主细胞的黏附功能为出发点,筛选43K OMP的黏附功能区;制备其单克隆抗体,并初步确定单克隆抗体的识别位点;结合生物信息学分析技术,筛选并验证牛坏死杆菌43K OMP的抗原表位。实验首先利用原核表达系统,重组表达了四个互相重叠的牛坏死杆菌43K OMP基因截短片段,表达后的蛋白经过纯化后分别制备兔多克隆抗体,利用辛酸-饱和硫酸铵法对多克隆抗体进行粗纯,纯化后的多克隆抗体与分别与BEND、MACT细胞进行黏附抑制试验,通过革兰氏染色法和平板计数法评定4个多克隆抗体抑制黏附的效果,以初步确定43K OMP的黏附功能区;随后制备43K OMP黏附功能区的单克隆抗体,ELISA检测单克隆抗体效价、抗体亚类检测试剂盒测定其亚类、Western blot对单克隆抗体进行鉴定,并初步筛选单克隆抗体的识别表位;最后利用生物信息学技术分析43K OMP的理化性质、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、二级结构、三级结构、亲水性、可及性、柔韧性、B细胞表位等参数,综合生物信息学分析结果选出位于黏附功能区内的抗原表位,最后将选出的预测表位肽合成,利用间接ELISA检测合成肽的反应活性、用间接免疫荧光法检测合成肽对BEND细胞和MACT细胞的黏附作用、最后用合成肽进行竞争抑制试验以验证其抑制牛坏死杆菌黏附细胞的效果。结果如下:（1）成功表达并纯化了牛坏死杆菌43K OMP基因截短片段,制备了多克隆抗体,通过多克隆抗体与BEND、MACT细胞的黏附抑制试验成功筛选出两段黏附功能区,分别是19～108aa和283～377aa;（2）成功制备了一株位于黏附功能区内的单克隆抗体,命名为1G7,其上清效价为1:3 200,腹水效价为1:104,初步鉴定其识别位点为283～306aa;（3）通过生物信息学分析技术,分析出43K OMP有34个磷酸化位点,无跨膜区,在1～20aa处有信号肽区域,预测出构象B细胞表位10个,选出4个位于黏附功能区内的线性B细胞表位并合成,具体氨基酸序列为T1（49～63aa）:VVQAPAKWKPNGSVG、T2（72～89aa）:VENKGKKATEENARKGWA、T3（286～302aa）:ETFWAWDKKDASMEEWP和T4（348～365aa）:GEYVNRENNKSTARYWRW。验证其具有较好的反应性,对BEND细胞、MACT细胞有较好的黏附作用,能竞争抑制牛坏死杆菌对BEND细胞、MACT细胞的黏附作用。本试验初步筛选出43K OMP黏附功能区,区间为19～108aa和283～377aa;成功制备了1株牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体命名为1G7,初步筛选出其识别表位为283～306aa;预测出牛坏死杆菌43K OMP有10个构象B细胞表位,4个位于黏附功能区内的表位肽,T1:VVQAPAKWKPNGSVG、T2:VENKGKKATEENARKGWA、T3:ETFWAWDKKDASMEEWP和T4:GEYVNRENNKSTARYWRW,经验证具有较好的免疫活性,可黏附BEND细胞和MACT细胞,能竞争抑制牛坏死杆菌对BEND细胞、MACT细胞的黏附作用。为进一步研究牛坏死杆菌的致病机理及抗菌药物的研发与设计提供了理论依据。