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隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）主要是由微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum,C.parvum）寄生于人和多种动物并可导致严重腹泻的一类寄生性原虫病。微小隐孢子虫感染的宿主较为广泛,且世界各地均有该病的报道,因此其危害的广泛性和严重性是显而易见的。微小隐孢子虫感染具有一定的自限性,即免疫功能正常的个体感染后可自愈,而免疫缺陷病个体（如艾滋病患者等）一旦感染便可引起严重腹泻,甚至波及生命,当前尚未有效的防治手段。目前关于微小隐孢子虫的免疫机制仍未完全清晰,但研究表明树突状细胞（Dendritic cell,DC）在先天性免疫中有重要的作用,这主要与其表面的Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）有关,TLRs是一类重要的模式识别受体,该受体可识别多种病原体相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns,PAMPs）,激活和调节天然免疫和适应性免疫应答。不同的TLRs对不同病原体识别能力是存在差异的,其中TLR4在对微小隐孢子的识别方面具有重要作用,但该功能尚未清楚。基于上述情况,本研究开展TLR4介导DC感染微小隐孢子虫相关免疫应答机制,以便阐明TLR4在微小隐孢子虫先天性免疫应答中发挥的功能特点,这可为隐孢子虫先天性免疫机制的研究提供手段。第一部分对鼠源TLR4基因的克隆与表达。采用RT-PCR技术对鼠源TLR4基因进行体外扩增和序列测定。接着将TLR4基因与p GEX-4T相连,构建重组质粒p GEX-4T-TLR4,经IPTG诱导目的蛋白的表达并对其纯化。第二部分体外开展TLR4介导DC黏附微小隐孢子虫试验。首先,采用梯度离心法分离、纯化微小隐孢子虫卵囊,经脱囊试验后释放出的子孢子由5（6）-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记,备用。同时制备小鼠骨髓源树突状细胞,培养至第7 d,于6孔培养板各孔中分别加入1 m L DC（1×10~6个/m L）,其中TLR4抗体封闭组加入1 m L标记的子孢子（2×10~5个/m L）和0.5 m L TLR4抗体（终浓度为1μg/m L）,TLR4抗体未封闭组加入1 m L标记的子孢子（2×10~5个/m L）和0.5 m L RPMI 1640培养基,空白对照组用1.5 m L RPMI 1640培养基补足,每组各3孔。感染2 h后,流式细胞仪检测各组CD11c+的相对表达水平,Flowjo软件比较各组中树突状细胞的成熟情况。感染24 h后,荧光显微镜观察各组微小隐孢子虫子孢子与树突状细胞的黏附情况。体内试验中以KM鼠为模型,共分为3组:空白对照组、TLR4抗体封闭组、TLR4抗体未封闭组,对后两组进行微小隐孢子虫感染试验并且在攻虫后2 d起,连续6天观察隐孢子虫卵囊的排出情况;分别在攻虫后第5 d、8 d和12 d时对TLR4介导的微小隐孢子虫感染后T淋巴细胞增殖情况进行分析;以β-actin为内参,分析TLR4、IL-4、IL-6、IL-12、IL-18和IFN-γ等免疫相关因子的表达情况;免疫组化方法分析TLR4抗体封闭后小肠、脾脏及淋巴结中TLR4的表达情况。各组细胞因子表达水平间的差异采用方差检验。实验结果表明:（1）成功克隆出鼠源TLR4基因,与Gen Bank中已报道的序列（NM021297.3）同源性达99%;构建了p GEX-4T-TLR4原核表达质粒,对其诱导表达获得,融合表达蛋白大小为54 k Da。（2）体外试验,流式细胞术检测结果显示:TLR4抗体封闭组和TLR4抗体未封闭组树突状细胞CD11c+表达量分别为67.67±1.80和83.37±3.73,表明TLR4抗体封闭组DC的成熟度低于TLR4抗体未封闭组,且与空白对照组（7.06±0.02）相比,差异显著（P<0.05）,而两试验组之间差异也显著（P<0.05）。荧光显微镜观察发现,TLR4抗体封闭组和TLR4抗体未封闭组中均有微小隐孢子虫子孢子与树突状细胞的黏附现象,但黏附能力是有差异的。（3）体内试验:经PE anti-mouse CD3、APC anti-mouse CD4和FITC anti-mouse CD8a标记后的细胞,流式细胞仪检测可知,TLR4抗体封闭组的CD4+CD8-与CD8+CD4-的表达量分别为20.62±0.723和70.99±1.132,TLR4抗体封闭组CD8+CD4-的表达量与对照组相比,差异不显著（P>0.05）;TLR4抗体未封闭组中CD4+CD8-与CD8+CD4-的表达量分别为50.11±1.651和30.28±2.829,且该组中CD4+CD8-与CD8+CD4-的表达量与对照组相比差异均显著（P<0.05）,表明TLR4封闭后T淋巴细胞的增殖有所降低。荧光定量PCR检测可知各细胞因子均在感染后的第8 d时,TR4未封闭组中TLR4、IL-4、IL-12、IL-18和IFN-γ的表达量与TLR4封闭组相比分别上调4.2、4.3、11.7、6.1和7.7倍,但IL-6的表达差异不明显。此外,免疫组化结果显示,各组织中TLR4表达量并不一致,在TLR4抗体未封闭组中脾脏、小肠和淋巴结表达水平均最高,其次是TLR4抗体封闭、最低的为组空白对照组。综上所述,TLR4能介导DC对微小隐孢子虫的识别和黏附作用,并诱导DC表面标记分子CD11c+表达量的增高,促进机体的免疫应答反应。同时也认为TLR4主要介导机体产生Th1型免疫应答反应抗微小隐孢子虫感染,这为阐明宿主抗微小隐孢子虫先天免疫特征提供了基本理论依据。