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Cathelicidin-BF (CBF)是第一个在爬行动物中发现的cathelicidin家族抗菌肽,研究表明抗菌肽CBF不仅具有高效的广谱抗菌活性和免疫调节功能,而且安全性好、不易产生耐药性,因此被认为是潜在的抗生素替代物。本研究利用small ubiquitin-related modifier (SUMO)融合技术在益生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus. subtillis, B. subtillis)中重组表达并分离纯化了融合蛋白SUMO-CBF与SUMO protease1,优化了SUMO protease1切割融合蛋白SUMO-CBF的条件,分离纯化了无内毒素的重组抗菌肽CBF并测定其体外抗菌活性,在此基础上研究了重组抗菌肽CBF对染菌小鼠有害菌和有益菌、肠道屏障和免疫功能的影响,初步探讨了重组抗菌肽CBF的生物学功能。主要研究结果如下：试验一、融合蛋白SUMO-CBF在枯草芽孢杆菌中的重组表达与分离纯化在分子伴侣的比较方面,选择SUMO、thioredoxin (Trx)和glutathione-S-transferase (GST)三种促进蛋白可溶表达的分子伴侣分别与抗菌肽CBF基因融合,插入枯草芽孢杆菌分泌表达载体pHT-43并转化至枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷型菌株WB800N,得到融合蛋白表达工程菌B. subtillis WB800N/pHT-43/SUMO-CBF、B. subtillis WB800N/pHT-43/Trx-CBF和B. subtillis WB800N/pHT-43/GST-CBF。 Western-blot结果表明：融合蛋白SUMO-CBF和Trx-CBF能被表达,且分子伴侣SUMO融合的抗菌肽CBF的量是分子伴侣Trx融合的1.3倍以上,因此选用分子伴侣SUMO开展后续试验。在表达条件优化方面,不同EPTG浓度(终浓度为0.25mM,0.5mM,1mM,2mM)、温度(16℃,25℃,30℃和37℃)和时间(0-18小时)条件对融合蛋白SUMO-CBF表达量的影响表明：融合蛋白SUMO-CBF在IPTG终浓度为1mM,温度为30℃,诱导12小时后表达量达到最高。在融合蛋白SUMO-CBF胞内外分布方面,Western-blot分析胞内外SUMO-CBF表达量结果表明：融合蛋白SUMO-CBF主要(约67%)被分泌至胞,外分泌效率较高。在胞外融合蛋白SUMO-CBF的分离纯化方面,通过亲和层析和阴离子交换法从1升B. subtillis WB800N/pHT-43/SUMO-CBF表达上清中纯化得到约22mg融合蛋白SUMO-CBF,纯度达到90%以上。试验二、SUMO protease1在枯草芽孢杆菌中的重组表达与分离纯化及活性研究在重组表达与分离纯化融合蛋白SUMO-CBF的基础上,开展了SUMO protease1的重组表达的研究,将SUMO protease1基因插入枯草芽孢杆菌分泌表达载体pHT-43并转化至枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷型菌株WB800N,得到工程菌B. subtillis WB800N/pHT-43/SUMO protease1。 Western-blot检测表达上清结果表明：SUMO protease1能被表达且表达产物具有活性。在表达条件优化方面,不同时间(0-18小时)对SUMO protease1活性的影响表明：SUMO protease1在IPTG终浓度为1mM,温度为30℃时,诱导10小时后活性达到最高。在SUMO protease1胞内外分布方面,Western-blot分析胞内外SUMO protease1表达量结果表明：SUMO protease1主要(约80%)被分泌至胞外,分泌效率高。在SUMO protease1的分离纯化方面,通过阳离子交换与亲和层析法从1升B. subtillis WB800N/pHT-43/SUMO protease1表达上清中纯化得到约1mg的SUMO protease1,纯度达到90%以上。在SUMO protease1的活性研究方面,不同量的SUMO protease1在4℃,pH8.0条件下过夜切割融合蛋白SUMO-CBF结果表明：0.05μg SUMO protease1能够切割2.5μgSUMO-CBF,酶与底物的比值达到1：50,切割效率达到80%。SDS-PAGE分析比较枯草芽孢杆菌和大肠杆菌来源的SUMO protease1切割活性表明：源于枯草芽孢杆菌的SUMO protease1活性接近于大肠杆菌来源的SUMO protease1。试验三、重组抗菌肽CBF的分离纯化与体外抗菌活性及其抗菌机制的研究在重组表达与分离纯化融合蛋白SUMO-CBF与SUMO protease1的基础上,开展了重组抗菌肽CBF的分离纯化的研究,通过亲和层析和阳离子交换法从22mg融合蛋白SUMO-CBF与0.44mg SUMO protease1切割反应体系中纯化得到了约3mg重组抗菌肽CBF,纯度达到95%以上。在重组抗菌肽CBF的体外抗菌活性方面,琼脂糖孔穴扩散试验和最小抑菌浓度试验研究表明：重组抗菌肽CBF与化学合成CBF的活性相当,其中对E.coli ATCC25922最小抑菌浓度为1μg/mL, E. coli K12为2μg/mL, E. coli K88为4μg/mL, P. aeruginosa CMCC27853为4μg/mL, S. aureus ATCC25923为4μg/mL。在重组抗菌肽CBF的抗菌机制方面,通过透射电镜观察发现重组抗菌肽CBF主要通过破坏细胞膜杀灭E. coli K88和S. aureus ATCC25923.试验四、重组抗菌肽CBF对小鼠感染大肠杆菌K88保护作用研究在分离纯化重组抗菌肽CBF的基础上,通过建立ICR小鼠腹腔感染大肠杆菌K88模型,研究了1.5mg/kg与3mg/kg重组抗菌肽CBF对染菌小鼠体内微生物菌群、肠道屏障和免疫功能的影响。小鼠徼生物菌群研究结果表明：在小鼠腹腔液、肝脏及肠系膜淋巴结中大肠杆菌方面,染菌后大肠杆菌数目显著升高；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF显著缓解了染菌引起的大肠杆菌数目的升高,且3mg/kg处理浓度效果优于1.5mg/kg。在小鼠盲肠内容物中大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸菌方面,染菌后大肠杆菌菌落数目显著升高,而双歧杆菌和乳酸菌数目显著降低；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF显著缓解了染菌引起的大肠杆菌菌落数目升高以及双歧杆菌和乳酸菌显数目的降低。肠道屏障功能的研究结果表明：在小肠形态结构方面,通过石蜡切片发现染菌后小鼠空肠绒毛变短；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF缓解了染菌引起的小鼠空肠绒毛变短。测定小鼠空肠绒毛高度、隐窝深度和二者的比值发现染菌后小鼠空肠绒毛高度显著降低,隐窝有降低的趋势,但差异不显著,绒毛／隐窝的比值显著降低；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF显著缓解了染菌引起的空肠绒毛高度和绒毛／隐窝的比值的降低。在小鼠空肠紧密连接蛋白基因表达方面,染菌后小鼠空肠claudin-1、occludin、ZO-1和ZO-2基因表达水平显著降低；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF显著缓解了染菌引起的小鼠空肠claudin-1、occludin、ZO-1和ZO-2基因表达水平的降低,使其恢复到正常水平。免疫功能研究结果表明：在免疫球蛋白水平方面,染菌后血清中免疫球蛋白IgA、IgG和IgM水平显著升高；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF显著缓解了染菌引起的IgA、IgG和IgM水平的升高,使其恢复到正常水平；染菌后sIgA水平显著提高；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF显著缓解了染菌引起的sIgA水平的升高。在脾脏淋巴细胞转化率方面,染菌后LPS和ConA刺激指数显著升高；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF显著缓解了染菌引起的LPS和ConA刺激指数的升高,使其恢复到正常水平。在肠道细胞因子方面,染菌后促炎因子MCP-1和TNF-a与抑炎因子IL-10表达水平显著提高；腹腔注射1.5mg/kg和3mg/kg重组抗菌肽CBF显著缓解了染菌引起的TNF-α、 MCP-1和IL-10表达水平的升高,且使MCP-1和IL-10恢复到正常水平。综上所述,本研究利用SUMO融合技术在枯草芽孢杆菌中重组表达并制备了具有活性的抗菌肽CBF,发现了重组抗菌肽CBF能有效缓解大肠杆菌K88感染对小鼠造成的损伤,为新型抗菌制剂的研发奠定了一定的基础。