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瘤胃产甲烷菌代谢产生的甲烷气体,既是饲料能量的损失,又能引起温室效应,因此成为当前的一个研究热点。了解瘤胃产甲烷菌群的组成及其多样性是对其菌群结构进行调控,并最终控制甲烷产生的基础。迄今为止,国内对瘤胃产甲烷菌群多样性的研究尚无报道,国外的相关研究多集中于绵羊和奶牛瘤胃中产甲烷菌的多样性,而对于产甲烷菌消化道不同部位(如瘤胃和盲肠)的分布方面鲜见报道。为此,本研究以晋南牛和山羊为试验动物,以克隆产甲烷古菌16S rRNA基因并测序的方法,研究了晋南牛和山羊瘤胃产甲烷古菌的多样性,并通过比较克隆库间的差异,揭示了产甲烷菌在瘤胃和盲肠中分布特点,为探讨我国反刍动物瘤胃甲烷调控奠定基础。试验分以下四部分进行。1研究瘤胃产甲烷古菌分子多样性的引物筛选采用两对古菌特异性引物(Arch f64/1386和1Af/1100Ar)和一对产甲烷菌特异性引物(Met86F/Met1340R)克隆晋南牛瘤胃产甲烷古菌的16S rRNA基因,每对引物对应的克隆库各随机挑选100个插入片段长度正确的克隆,比较不同引物建立的克隆库,以选择出适合反映瘤胃产甲烷古菌多样性的引物。结果显示,利用引物Archf364/1386建立的克隆库中,克隆的最相似菌分别为4株甲烷短杆菌1Y(61%)、SM9(23%)、NT7(14%)和AK-87(2%)。利用引物1Af/1100Ar建立的克隆库中,克隆分别与Methanobacterium aarhusense(72%)和Methanosphaera stadtmanae DSM 3091 (28%)相似。利用引物Met86F/Met1340R建立的克隆库中,除以上4株甲烷短杆菌(所占比例分别为47%、26%、11%和3%)和类似M. aarhusense (1%)和M. stadtmanae (3%)的序列外,还包括Methanomicrobium mobile (2%)以及7%与Aciduliprofundum boonei相似性在81%-82%之间的序列。结果说明,相对其它两对引物,引物Met86F/Met1340R克隆的瘤胃产甲烷古菌种类最多,归属于甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、甲烷微菌属(Methanomicrobium),以及未知菌等广域古菌的五个分支,能较全面地反映晋南牛瘤胃产甲烷菌菌群结构,适于研究瘤胃产甲烷菌的多样性。结果同时发现,晋南牛瘤胃中,有25个OTU属于广域古菌的未知序列,提示瘤胃中存在大量的未知产甲烷菌。2产甲烷古菌在瘤胃中的生态分布研究采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R,分别建立了晋南牛瘤胃液相(liquid-associated methanogen, LAM)、附着于瘤胃固相(solid-associated methanogen,SAM)和附着于瘤胃壁(epithelium-associated methanogen, EAM)上的产甲烷古菌16SrRNA基因克隆库,以比较瘤胃产甲烷菌在此三相间的分布差异。LAM、SAM和EAM三个克隆库检测的克隆数分别为268个、135个和267个。比较三个克隆库,其中皆以甲烷短杆菌属的克隆为主,分别占克隆总数的86.94%、77.78%和76.12%,且均含有1Y和SM9两株产甲烷短杆菌及类似M. alcaliphilum、M. stadtmanae和A. boonei的序列;此外,可活动甲烷短杆菌和类似M. aarhusense、M. stadtmanii和Methanobrevibacter sp. AbM4的序列仅存在于LAM克隆库中；反刍兽甲烷短杆菌仅存在于SAM克隆库中；类似Methanobrevibacter sp. SM9的序列仅存在于EAM克隆库中；而类似Methanobrevibacter sp. AK-87的序列存在于LAM和SAM克隆库中；在LAM. SAM和EAM克隆库中,分别有12.30%、23.69%和24.71%的克隆是未确定的广域古菌序列,其中有五个序列(E17、E18、E19、L25和S14)是新发现的广域古菌序列。结果表明,产甲烷古菌在瘤胃中的分布不均匀,附着于瘤胃液相、固相和上皮上的产甲烷古菌菌群存在一定的差异。3瘤胃与盲肠中产甲烷古菌的比较研究采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R,建立了晋南牛瘤胃和盲肠中产甲烷古菌的克隆库,以比较两个消化部位产甲烷古菌菌群的差异。每个克隆库中分别随机检测200个克隆,根据限制性内切酶酶切和测序的结果,瘤胃克隆库中的克隆分别与M. alcaliphilum (1%), M. aarhusense (2%), M. stadtmanae (3%), M. stadtmanii (1%),可活动甲烷微菌(2%),A. boonei (11.5%),和甲烷短杆菌属的反刍兽(0.5%),SM9(26%),1Y(44.5%),AK-87(6%),NT7(2%),AbM4(0.5%)等菌最相似。盲肠克隆库中,克隆的最相似菌分别为M. alcaliphilum (5%), M. aarhusense (1%), M stadtmanae (4%),和甲烷短杆菌属的SM9(54.5%),1Y(27%),AK-87(6.5%),NT7(2%)。比较两个克隆库,在盲肠内未克隆到存在于瘤胃克隆库中的可活动甲烷微菌和类似于Methanobrevibacter sp.1Y、M. stadtmanii、Methanobrevibacter sp. AbM4和A. boonei的克隆,而瘤胃中未克隆获得类似Methanobrevibacter sp. SM9的克隆。结果表明,瘤胃与盲肠的产甲烷菌菌群存在一定的差异,盲肠中的产甲烷菌种类较单一。4山羊瘤胃产甲烷古菌的分子多样性研究采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R和古菌通用引物w017/w002研究了山羊瘤胃产甲烷古菌16S rRNA基因的多样性,以反映山羊瘤胃产甲烷菌菌群。每个克隆库随机挑选100个克隆。引物Met86F/Met1340R建立的克隆库中,克隆的最相似菌分别为M. stadtmanae (1%)、M. aarhusense(2%)、A. boonei (3%)及6株甲烷短杆菌AK-87(62%)、ZA-10(19%)、OCP(7%)、SM9(2%)、30Y(2%)和1Y(2%)。引物w017/w002建立的克隆库中,未知广域古菌克隆占克隆总数的97%,克隆分别与Methanosphaera stadtmanii(47%)、Methanobrevibacter sp. SM9(1%)、Methanobacterium sp. DSM 11106(21%)、M. stadtmanae DSM 3091(4%)、Methanobacterium alcaliphilum (3%)、Methanobacterium sp. OM15 (1%)、Picrophilus oshimae (4%)和A. boonei(19%)最相似,但此对引物能克隆出细菌。