能源危机是当今人类共同面临的难题,化石燃料几近枯竭,木质纤维素原料因其蕴含的巨大生物能成为目前最具潜力的新能源材料。以木质纤维素为原料的生物质能源研究,除焚烧产能外,多利用微生物进行发酵转化生成燃料。木质纤维素原料水解后五碳糖的含量约为33%,其中90%是木糖,然而五碳糖不能被大多数微生物菌种有效利用,因此要实现全糖利用,提高生物质能源的转化率,必须要大力开发适宜的微生物菌种。自然界已知的微生物有十万余种,但可以直接利用五碳糖的野生型菌株仅仅只有100余种,优良菌种的筛选和机理研究工作是工程菌构建、菌种遗传改良的基础。本文通过菌种筛选对细菌、酵母和丝状真菌菌株的五碳糖发酵性能进行了研究,并对低产菌株进行了紫外及⁶⁰Co-γ射线辐射诱变,获得了相应的突变株。并最终筛选出一组利用五碳糖产乙醇的尖孢镰刀菌高低产差异菌株,利用高通量测序技术对差异菌株的不同发酵时期进行了转录组测序及生物信息学比较分析,分别获得了两菌不同发酵时期、同一发酵时期及在木糖代谢通路上的差异表达基因。基于大量差异基因的功能与线粒体有关,我们对乙醇高产菌mh2-2的线粒体基因组进行了拼接和分析,通过与镰刀菌属的比较,研究了其组成及遗传发育特性,获得了大量的生物学数据,为后续微生物利用木质纤维素生产乙醇的高效转化研究提供试验基础和数据支持,主要研究成果如下:（1）从本实验室多年收集的111株生物质糖化/乙醇发酵的菌株中挑选出被报道可能具有五碳糖发酵产乙醇能力的3种类型的菌株18株（酵母4株,细菌1株,丝状真菌13株）,进行五碳糖发酵产乙醇试验,并以葡萄糖转化乙醇能力高的酿酒酵母为对照。结果表明,CICC1960树干毕赤酵母（Pichia stipitis）和肠杆菌（Enterobacter sp.）在TTC筛选中,显示出有明显的产乙醇能力,通过五碳糖液体发酵试验的结果显示,两菌的乙醇产量分别为4.088 g/L和1.599/L,其中树干毕赤酵母优于其他酵母。为获得乙醇高产突变株,进一步提高乙醇的产量,通过⁶⁰Co-γ射线辐射诱变和紫外诱变对酵母和肠杆菌进行诱变,试验结果显示,诱变对获得野生型突变株材料有效,树干毕赤酵母（Pichia stipitis）⁶⁰Co-γ射线辐照诱变突变株的乙醇产量可达15.6g/L,约为原始菌株乙醇生成量的4倍。而肠杆菌经过紫外诱变后,乙醇产量未有较大的变化。另外,在丝状真菌中,13株不同来源的尖孢镰刀菌菌株的五碳糖液体发酵试验结果显示,Foc-mh2-2（M菌）的乙醇生成量最高,达到16.9g/L,优于树干毕赤酵母诱变的高产突变株。为进行差异菌株的转录组比较,选择乙醇生成量为2.8g/L的Cs20（N菌）,作为乙醇生成量相对较低的菌株,与M菌组成一对差异菌株,M和N菌同为尖孢镰刀菌,亲缘关系接近,是组学比较分析的理想材料。（2）通过五碳糖代谢关键酶基因XYL1,XYL2,XKS1,ZWF1在M、N菌基因组中的比对发现,均不存在缺失现象。进而对M、N菌进行不同发酵时期的转录组分析,分别提取M、N两菌乙醇生成的起始期、增长期、衰退期三个时期的RNA作为样品,进行转录组测序。由Illumina Hiseq2500测序仪检测完成,测序的数据达到4Gb以上,QC达到90%以上,将Clean data进一步过滤得到High quality数据,使用Trinity（版本r20140717）做de novo组装,即把每个菌株的6个样品的转录组数据混合起来组装得到转录本/基因序列,然后用BWA（版本0.7.10）把每个样品测序的reads比对到组装好的转录本序列;如果存在reads唯一比对到该转录本序列,那么认为这个转录本在该样品中存在且表达;根据比对信息,确定每个样品的转录本/基因序列。对拼接得到的转录本/基因序列,使用Trinity的TransDecoder程序预测编码氨基酸的序列。在Trinity的算法中,很多基因的同源体isoform（包括旁系同源基因和可变剪切mRNA）都拼接出来了,如Cs20编码蛋白的转录本/基因有19070个,其中unique转录本/基因有10171个,有3752个unique转录本/基因至少有2个同源体;相似的,Foc-mh2-2有20973个编码蛋白的转录本/基因,其中11659个unique转录本/基因,有4018个unique转录本/基因至少有2个同源体。对于编码蛋白的转录本,使用其氨基酸序列比对到NCBI的KOG数据库,分析过程中BLASTP选用的阈值为1e-5。（3）比较同一菌种不同发酵时期时发现,高产菌（M）和低产菌（N）有共同的极显著差异基因簇U,即细胞内运输,分泌及囊泡运输基因簇,发现大量的差异基因的功能注释为ABC转运蛋白,进而使用Inparanoid软件包对两菌的差异基因进行同源性关联,结果表明,在五碳糖发酵产乙醇的衰退期2组注释功能为ABC transporter的直系同源基因在差异菌株中都有表达,因此推测ABC transporter基因可能在发酵后期发挥着重要作用。（4）比较同一发酵时期差异菌株的表达量数据可知,三个发酵时期差异菌株M、N均在翻译、核糖体结构及生物合成（Translation,ribosomal structure and biogenesis）的基因簇及复制、重组和修复（Replication,recombination and repair）的基因簇在基因表达数量上有极显著差异。并在其中发现了一些仅在高产菌株有表达而低产菌株没有表达的差异基因,这些转录本数据可以为后续的机理研究提供支撑。（5）比较差异菌株在不同时期在五碳糖代谢通路上的基因表达量可知,L-艾杜糖醇脱氢酶（L-iditol2-dehydrogenase）和木酮糖激酶基因（XYLB）在高产菌株M中为上调基因,在低产菌株N中为下调基因,这两个基因对维持代谢流流向乙醇生成的方向有重要的作用。推测这两个基因可能与造成五碳糖代谢差异有关。通过RT-PCR检测了具体基因的表达情况,结果与测序结果一致。（6）高低产菌株的转录组分析时发现不少差异基因与线粒体有关,通过拼接获得五碳糖产乙醇的高产菌株mh2-2的完整线粒体基因组（46 kb）,其长度不同于其他报道的镰刀菌,现已将数据上传到NCBI GenBank,登记号:MF155191。比较线粒体基因组的组成结果显示,包括mh2-2在内的10个镰刀菌线粒体基因组（33¹03 kb）中,内含子的数目与非典型基因的数目与线粒体基因组的大小差异密切相关。并且根据非典型基因的分布,菌株被聚为三个簇,其中两个簇的物种在系统发育树中被划分为三个明显不同的分支,这表明线粒体大小差异和基因数目的变化明显区别于物种的进化。通过比较基因组组成元件的序列长度,发现依次是编码蛋白区域（CR）、内含子/基因间区（IR）的序列影响镰刀菌线粒体基因组的大小差异。此外,基于核酸内切酶基因的系统发育树分析,推测:mh2-2及镰刀菌祖先的线粒体基因组经过水平转移获得非典型基因后,在基因组内部发生多次复制/转移事件,在物种的分化过程中,有些非典型基因发生丢失,就是基因复制/转移和丢失事件导致进化过程中镰刀菌线粒体基因组大小发生变化。还首次将糖代谢产乙醇及植物侵染过程中线粒体基因的表达量进行了分析。通常认为线粒体的核酸内切酶基因（HEGs）是自私基因元件,不干预宿主的生理活动,但数据显示随着生理功能的显现,mh2-2及另一株尖孢镰刀菌FoxCR4相应的HEGs基因显示出上调表达,因此推测线粒体基因可能在这些生物学过程中发挥着作用,研究数据可为之后的功能基因挖掘提供线索。