A组轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体,全球每年由于轮状病毒感染导致的死亡约453,000人,造成严重的社会负担和经济负担。安全、有效的疫苗是控制轮状病毒感染和发病的重要手段。目前已有两种轮状病毒口服疫苗经FDA批准上市,分别为默克的RotateqTM和葛兰素史克的RotarixTM,但在亚州与非州等轮状病毒高负担地区的保护率显著低于欧美等发达国家和地区,且二者作为减毒活疫苗均存在一定的安全风险。因此,开发一种更加安全、有效的疫苗对控制轮状病毒的感染与发病,特别是严重腹泻和死亡具有重要意义。基因工程表达的病毒样颗粒疫苗被认为是一种较为理想的轮状病毒候选疫苗,但目前轮状病毒病毒样颗粒的大规模制备还存在一定的挑战。在本人硕士阶段和本团队其他人员的研究中,我们已经在大肠杆菌中成功表达轮状病毒的结构蛋白VP2和VP6,并在体外成功的组装了病毒样颗粒VP6-VLP和VP2/6-VLP。本研究主要对原核表达的VP6、VP6-VLP和dl2/6-VLP的理化性质和免疫保护性进行研究,综合考察其作为轮状病毒候选疫苗的可行性。首先,通过比较与15株由天然病毒免疫制备的单克隆抗体的反应性发现,dl2/6-VLP的反应性最高,抗原性最好,表明dl2/6-VLP较VP6和VP6-VLP具有更接近于天然病毒的构象。其次,热稳定性研究发现,dl2/6-VLP具有更高的Tm值和和浊点,,且热处理后的dl2/6-VLP与构象型单抗仍具有较高的反应性,而同样处理后的VP6和VP6-VLP与单抗的反应性显著降低,说明dl2/6-VLP较VP6和VP6-VLP具有更好的热稳定性。其后,将VP6、VP6-VLP和dl2/6-VLP与弗氏佐剂混合后免疫小鼠,发现三者均能产生良好的免疫应答,刺激小鼠产生的抗VP6抗体滴度并无显著差别;但在母传抗体模型中发现dl2/6-VLP免疫组乳鼠在接种轮状病毒后的腹泻程度、小肠组织病变程度和小肠中轮状病毒量均显著低于VP6和VP6-VLP免疫组,而与灭活病毒免疫组无显著差异,表明双层病毒样颗粒dl2/6-VLP与VP6三聚体或VP6-VLP相比具有更高的免疫保护性。由于弗氏佐剂无法用于人体,本研究进一步评价了在铝佐剂的条件下重组d12/6-VLP的免疫原性与免疫保护性,发现d12/6-VLP与铝佐剂混合后免疫小鼠产生抗VP6的抗体滴度显著低于弗氏佐剂,但与同样佐剂条件下灭活病毒免疫产生的抗VP6抗体滴度无显著差异。但在小鼠母传抗体模型中,重组d12/6-VLP的免疫保护显著低于灭活病毒。以上研究表明,当抗VP6抗体滴度足够高时(弗氏佐剂免疫)可以提供足够的免疫保护,但同时,中和抗体在轮状病毒的免疫保护中也发挥着重要作用。因此,为了进一步提升铝佐剂情况下dl2/6-VLP的免疫保护性,本研究也开展了轮状病毒中和抗原的初步研究,并在大肠杆菌中成功表达了轮状病毒中和抗原VP8和其截短蛋白VP8C(aa65-231),发现VP8易集聚和降解,VP8C可形成稳定均一的二聚体,但VP8的免疫保护性显著高于VP8C。此外,本研究还通过定点突变技术构建了一系列VP6突变体,发现D90、R106或D380突变为丙氨酸均不影响VP6三聚体的形成,但无法组装形成VP6-VLP,但在VP2的存在下仍可形成d12/6-VLP,表明静电相互作用是VP6三聚体间的主要作用力,而双层颗粒dl2/6-VLP的形成主要依赖于VP2和VP6的相互作用。综上所述,原核表达的重组轮状病毒dl2/6-VLP相比VP6三聚体和VP6-VLP具有更高的抗原性、热稳定性和免疫保护性,更适合作为轮状病毒的候选疫苗;重组dl2/6-VLP在铝佐剂条件下刺激小鼠产生的抗体滴度较低,不能产生足够的免疫保护,还需进一步研究提高其在铝佐剂条件下的免疫原性,从而进一步提升其免疫保护性;或者需要与中和抗原混合一起作为疫苗。而原核表达的中和抗原VP8仍需开展进一步的研究工作,以期获得既稳定、均一且高免疫保护性的VP8重组蛋白。总之,本研究为轮状病毒基因工程疫苗的进一步研究奠定了一定的基础,有助于推动轮状病毒基因工程疫苗的研发与应用。