RNA干扰(RNA interference,RNAi)在绝大多数生物中是一种非常保守的基因表达调控机制,在发育调控、基因组维持等方面发挥重要作用。RNAi是由双链RNA诱导的多步骤、多因子参与的过程,其中siRNA发挥了核心作用,可引起同源基因mRNA特异性降解,能够有效的抑制基因的表达,目前已发展成为强有力的遗传分析工具。应用RNAi技术,在线虫、果蝇和哺乳动物细胞已实现全基因组范围的基因功能分析和筛选,然而在高等植物中目前尚无相关研究报道。本研究以此为出发点,构建了拟南芥的RNAi文库,并初步创建了基于RNAi的拟南芥突变体库。本研究依据滚环复制的原理,创建了新的发卡RNA构建系统,即Rolling circle amplification- Mediated Hairpin RNA system(RMHR system),以此为基础,利用拟南芥cDNA文库,构建了片段化的拟南芥cDNA文库3个,首次构建出拟南芥RNAi文库2个。获得的拟南芥250和350 RNAi文库的库容量合计6.85×105 cfu,随机挑取12326个克隆进行测序分析,测序结果表明其中含有2593个不同的基因,占测序克隆总数的21.04%,约占拟南芥基因总数的10%,因此推算这个RNAi文库的容量,能够覆盖拟南芥基因组绝大部分的基因。进一步分析这些测序克隆的靶基因,均匀分布在拟南芥染色体组上,具有催化、结合、电子传递、生殖等多种生物学功能,并参与到氨基酸的代谢、生物碱的合成、脂肪酸的转化等多种代谢途径。利用RNAi文库,通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,目前获得了5000多个经潮霉素筛选为阳性的转基因植株,部分突变株具有明显的表型,表现在植株的分枝和莲座叶增多,植株畸形;叶片变得狭长、卵圆形或卷曲、叶色变黄或加深;部分植株花的发育异常,出现不育;还有部分植株出现生理的表型,如在蔗糖培养基上不能萌发,而在葡萄糖培养基上则能萌发并正常生长等。选取部分转基因植株, RBCS,CAB,SAPX等靶基因表达分析表明,大部分转基因植株hpRNA靶基因的表达均有不同程度的降低,说明RNAi突变体中hpRNA发挥了基因沉默效应。该研究结果说明RNAi文库以及由此获得的RNAi突变体库在基因功能的大规模鉴定中可以发挥重要作用,而且与其它的突变体库相比,RNAi突变体在对基因家族和多拷贝基因的功能分析上具有自身的特点和优势。RMHR系统可以将任何物种来源的DNA片段或cDNA文库构建成相应的RNAi文库。利用该系统构建的长发卡RNA(Long hairpin RNA, lhRNA)文库,不仅可以克服目前的短发卡RNA(Short hairpin RNA, shRNA)文库的不足,也可以弥补目前高等植物中其它突变体库的一些不足。本研究首次证实了RMHR系统和RNAi文库在植物基因大规模鉴定中的有效性,开辟了一种新的高通量的基因挖掘系统,在玉米、水稻、小麦、棉花、油菜、大豆等重要农作物以及动物、真核微生物的功能基因组学研究和遗传改良方面具有广阔的应用前景。