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海洋中蕴藏着丰富的微生物资源，这些微生物长期生存在低温、高盐、高压等极端环境中，体内形成了与环境相适应的独特的代谢途径和酶系。为了获取营养，异养型海洋微生物向细胞外分泌大量有机质水解酶，这些有机质水解酶不仅是高分子颗粒有机质向溶解有机质转化的重要推动者，而且具有潜在工业应用价值。温度是重要的环境因子，微生物对极端环境的适应需要与生命活动密切相关的蛋白参与，认识高温蛋白的温度适应机制是阐释微生物生命适应机理的重要内容，也为改良工业蛋白的耐热特性提供理论依据。本研究从一株深海耐热细菌中克隆表达了高温α-淀粉酶，在对其与高温适应性相关的氨基酸残基进行深入研究的基础上，通过半理性设计进一步提高其热稳定性。主要研究结果如下： 从深海沉积物中分离到一株产高温α-淀粉酶的菌株SCSIO15121，鉴定该菌株为Bacillus属。根据芽孢杆菌属α-淀粉酶的保守序列设计简并引物扩增编码α-淀粉酶基因的部分序列，再根据获得的部分序列信息设计引物扩增全长编码基因。全长α-淀粉酶基因amy121阅读框包含1539 bp的核苷酸，对应编码512个氨基酸，其中N端前29个氨基酸为信号肽序列。重组酶经过金属螯合层析纯化得到分子量约为55 kDa的α-淀粉酶蛋白AMY121，该酶的比活力为780 U/mg，最适pH为7.0，最适温度为75℃，在100℃能保持60％的酶活性，并且该酶在85℃（加入终浓度为5 mM Ca2+）条件下的t1/2为55.31 min，表明该酶具有优良的耐热性能。 将高温淀粉酶AMY121的氨基酸序列与报道的同源高温、中温淀粉酶的氨基酸序列进行比较，发现相较于中温淀粉酶，高温淀粉酶在一级结构上存在两个氨基酸“EG”的缺失。为了验证两个氨基酸的缺失是否带来淀粉酶热稳定性的提升，我们设计了两组突变:AMY12-EG和BAA-△EG。突变酶AMY121-EG最适温度相对AMY121野生酶降低了5℃，在85℃的t1/2为5.98min，比AMY121缩短了8.39倍。在对照实验组中，将BAA的“EG”两个氨基酸删除，BAA-△EG最适作用温度提高10℃，在75℃的耐热性提高3.39倍。同源建模发现“EG”氨基酸的插入会导致AMY121的Lys209的构象发生显著变化，因此对Lys209进行饱和突变，结果发现19个饱和突变酶的最适温度和温度稳定性都有不同程度的下降。其中，K209T的热稳定性下降最为显著，最适作用温度为50℃，比野生酶降低了25℃，K209T的T5015为39.44℃，而野生酶的T5015为70.5℃。 通过改变Lys209周围半径4(A)内的氨基酸实现其结构微调。选取了Y187，K205，F206和D231四个位点构建饱和突变体库。通过对构建的突变体库进行耐热特性筛选，获得了Y187E和K205L这两个温度稳定性提高的突变子。Y187E、K205L的最适作用温度为80℃，AMY121的T5015为70.50℃，Y187E和K205L较野生型的T5015分别提升了0.73和8.52℃。AMY121在75℃下的t1/2为7.04 min，Y187E的t1/2为7.29 min，K205L的t1/2为31.08 min，比野生型提高了4.4倍。