金霉素是Duggar于1948年从土壤微生物产金链霉菌(Streptomyces aureofacines)中分离得到,属广谱抗生素,是第一代天然四环素家族抗生素。它通过与细菌核糖体30S亚基的氨酰-tRNA特异性结合,阻止肽链的延伸,抑制细菌蛋白质的合成,从而发挥抗菌作用。至今在畜牧业有广大的需求,作为农用抗生素广泛添加于动物饲料中,每年可达十几万吨。因此,开展金霉素生物合成研究具有很大实际应用价值。目前,已经从高产金霉素的产金链霉菌工业菌株F3中克隆了金霉素的生物合成基因簇,结构基因的相关研究揭示了金霉素是由II型聚酮合酶合成并经多酶催化形成的生物合成途径。生物信息分析发现,金霉素生物合成基因簇中有4个调控基因,其中ctcA、ctcB和ctcS分别与大器环素生物合成基因簇内dacT3、dacT1和土霉素生物合成基因簇内oxyTA1同源,然而它们在金霉素生物合成中可能的调控作用目前尚不清楚。首先,研究了金霉素生物合成基因簇中属于MarR家族的调控基因ctcS,通过构建ctcS基因缺失和回补突变株LJIA03和LJIA04,对比野生型发酵检测,发现ctcS正调控四环素和金霉素的产生。对金霉素生物合成簇内共转录单元进行分析,发现大部分生物合成基因成首尾重叠分布在6个共转录单元上。荧光定量RT-PCR结果显示突变株LJIA03对比野生型工业菌株,结构基因转录水平基本不变,而负责编码外排蛋白的基因ctcR转录提高。EMSA实验确认CtcS能够作用于ctcR-ctcS的基因间隔区域,从而影响编码外排蛋白的基因ctcR。DNase I Footprinting实验定位了相互作用的两个motif。蛋白纯化过程中发现CtcS重组蛋白为二聚体,因此,推测CtcS是以二聚体形式作用于两个motif而起到调控作用。随后,研究了金霉素生物合成基因簇中属于SARP家族调控基因ctcB。构建了ctcB基因缺失菌株LJIA02,发酵检测表明该突变株失去了四环素和金霉素的产生能力,荧光定量RT-PCR结果显示突变株LJIA02对比野生型工业菌株,4个共转录单元和ctcQ的转录水平下降明显。根据SARP蛋白家族结合DNA特征,通过生物信息学预测CtcB结合区域,ctcG-D、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W基因前具有保守的串联重复序列,CtcB与之结合激活这些基因的转录,这与ctcB基因缺失突变株中荧光定量RT-PCR的实验结果相吻合。然而ctcH-K的-10区前也有类似间隔特征的一段序列,可能正是该序列与保守序列之间的差异,导致转录下调水平不如具有保守序列的ctcG-D、ctcQ、ctcN-P和ctcTW基因明显。ctcB在金霉素生物合成过程中必不可缺,对金霉素生物合成基因簇内结构基因转录起正调控作用。最后,研究了金霉素生物合成基因簇中属于LuxR家族调控基因ctcA。构建了ctcA基因缺失菌株LJIA01,发酵检测表明该突变株失去了四环素和金霉素的产生能力,荧光定量RT-PCR结果显示突变株LJIA01对比野生型工业菌株,金霉素生物合成基因的转录水平大大降低。ctcA在金霉素生物合成过程中必不可缺,对金霉素生物合成中的基因正调控机理有待进一步研究。总之,本研究在前期金霉素生物合成研究的基础上,组合运用体内基因置换,生物信息分析,金霉素生物合成基因的转录分析,以及EMSA和DNase I footprint检测蛋白-DNA相互作用体外生化分析,确定了3个调控基因ctcS、ctcB和ctcA是作为正调控基因参与金霉素的生物合成。这些工作不仅增加对金霉素生物合成机制的理解,也为通过基因工程手段提高产金链霉菌工业菌株F3中金霉素的产量奠定了基础。