绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)是一种细菌性蛋白质毒素,由铜绿假单胞菌属绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌。PEA可将真核细胞内蛋合成白质的关键延长因子EF-2核糖基化并使其失活,从而使蛋白质的合成受到抑制,最终导致细胞的死亡。此前的很多研究集中在PEA毒素催化反应阶段,对前期的与细胞膜受体结合和胞内转运路径的相关研究较少。　　为追踪绿脓杆菌外毒素A进入细胞质的时间和效率,我们构建四种荧光蛋白标记和两种海肾荧光素酶标记的绿脓杆菌外毒素A的融合毒素,来探究毒素进入细胞的量与时间的关系,以及毒素进入细胞质的路径。研究结果发现加毒素蛋白1小时后,进入细胞质的总毒素量占结合细胞表面总毒素量的14.75％;其中整个毒素片段占11%;酶切后的毒素片段占3.72%。;2小时后达到最大值,之后随着培养时间的降低有所降低,但降低量并不太大。加入nocodazole后细胞质中总毒素量有所降低,加入monesin或NH4Cl后,进入细胞质中的整个毒素蛋白分子的量被抑制50%,酶切后的毒素C片段量明显被完全抑制。　　为研究绿脓杆菌外毒素A在细胞内的裂解和酶切效率,我们运用荧光共振能量转移(Fluorescent resonance energy transferring,FRET)的方法设计了具有两个荧光标签的PEA融合毒素,如RPG(DsRed2-PE44-eGFP)。结果发现毒素以脉冲形式进入细胞半小时后,供体荧光量开始升高,说明部分毒素开始被酶切;随着时间的延长,供体荧光升高量并不大,说明大部分毒素没有被酶切;另外还发现furin的切割具有区域性,说明Furin的切割主要在亚细胞结构中进行。