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研究背景及目的结肠炎相关性结直肠癌（colitis-associated colorectal cancer,CAC）是一种以临床可检测到炎性肠病（inflammatory bowel disease,IBDs）为先发症状的结直肠癌（colorectal cancer,CRC）类型。慢性炎症在CAC发生、发展中起着积极的作用。针对炎症和参与炎症过程的关键分子或信号分子可能是一种良好的CAC预防和治疗策略。具有抗炎、较少副反应的中草药可通过参与癌变过程的多种分子、多个信号通路,发挥抗CAC作用。白芍（Radix Paeoniae Alba,RPA）是一种传统的中药,能够下调炎症反应,具有潜在的抗CAC作用。芍药苷（paeoniflorin,PF）是从RPA中提取的一种单萜类糖苷化合物。PF是RPA的主要有效成分,具有挥抗炎、免疫调节作用。本研究旨在探讨PF对CAC的预防效果及分子机制。研究方法1.文献计量学分析:根据中英文文献检索策略,分别从中文数据库中国知网（China National Knowledge Infrastructure,CNKI）、英文数据Web of Science Core Collection数据库（Wo SCCd）进行文献检索。利用Cite Space 5.8.R1软件从年度发表数量、国家/地区、机构、作者/被引作者、重要期刊、参考文献、关键词等方面全面分析RPA在肿瘤防治中的研究现状以及应用前景。2.网络药理学研究:利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine for Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）和疾病数据库获得RPA活性成分和抗CAC的候选靶标。采用Cytoscape3.7.2软件构建候选靶标蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络识别RPA抗CAC的核心靶标。GO和KEGG富集分析预测RPA抗CAC可能的作用机制。最后采用Schr?dinger软件通过分子对接技术评价关键靶标与活性成分的结合程度。3.PF对AOM/DSS诱导CAC小鼠模型的预防效果:首先,采用氧化偶氮甲烷（azoxymethane,AOM）和葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）联合干预小鼠,造成结肠黏膜上皮的持续损伤/修复病程,建立CAC小鼠模型。AOM/DSS模型组小鼠单次腹腔注射10 mg/kg的AOM溶液。1周后进行3个周期21 d的2.5%DSS刺激。空白对照组小鼠给予生理盐水（normal saline,NS）代替AOM,饮用不添加DSS的水。通过观察小鼠体重、粪便形状以及结肠大体、组织学结构的变化,判断CAC小鼠模型是否建立成功。同时,以单独给予AOM诱导的散发型CRC小鼠模型以及DSS诱导的慢性肠炎小鼠模型作为模型对照。比较各处理小鼠肠道肿瘤发生、结肠组织学结构改变以及细胞因子含量,观察炎症对CAC的促进作用。随后,雄性昆明小鼠随机分为空白对照组（Blank control组）、溶剂对照组（Solvent control组）、模型对照组（AOM/DSS+NS组）、PF低剂量组（AOM/DSS+PF（15 mg/kg）组）、PF中剂量组（AOM/DSS+PF（30 mg/kg）组）、PF高剂量组（AOM/DSS+PF（60 mg/kg）组）、阳性对照组（AOM/DSS+aspirin组）。AOM/DSS+NS组、AOM/DSS+PF（15 mg/kg）组、AOM/DSS+PF（30 mg/kg）组、AOM/DSS+PF（60 mg/kg）组和AOM/DSS+Aspirin组小鼠单次10 mg/kg AOM腹腔注射。1周后,AOM/DSS+PF（15 mg/kg）组、AOM/DSS+PF（30 mg/kg）组、AOM/DSS+PF（60 mg/kg）组和AOM/DSS+Aspirin组小鼠在接受DSS刺激前给予药物治疗并持续12周。其中,PF治疗组按15、30和60 mg/kg 3个浓度分别进行灌胃治疗。阳性对照组小鼠给予30 mg/kg的Aspirin进行灌胃治疗。Blank control组、AOM/DSS+NS组给予NS代替药物,Solvent control组给予含0.2%二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide,DMSO）的NS。药物治疗结束后,对小鼠的体重、结肠荷瘤、结肠组织结构、肿瘤细胞增殖标记物Ki67和细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达进行检测,评估PF对CAC小鼠的预防效果。采用苏木精-伊红（hematoxylin＆eosin,H＆E）染色法观察小鼠肝肾组织结构改变,检测血清谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,AST/GOT）、谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase,ALT/GPT）、肌酐（creatinine,CRE）和尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）水平,评估药物对小鼠肝、肾毒性。4.PF对AOM/DSS诱导CAC小鼠模型的作用机制:首先,采用抗体芯片技术检测血清18种细胞因子的含量,酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测结肠组织白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-17A和IL-10的含量。然后,免疫组化技术检测结肠肿瘤组织中F4/80和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）表达,实时定量PCR（real-time quantitative,RT-PCR）检测结肠肿瘤组织中维甲酸受体相关孤儿受体-γt（retinoic acid receptor-related orphan receptor-γt,RORγt）、IL-17A和叉头样转录因子3（forkhead box protein 3,Foxp3）m RNA表达。随后,通过免疫印迹法检测IL-6下游分子信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）的表达。接着,采用TUNEL染色法检测结肠肿瘤组织中凋亡细胞的数量,免疫印迹法检测Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达,评价PF对CAC小鼠结肠肿瘤凋亡的影响。最后,荧光显微镜下观察结肠肿瘤组织LC3/P62荧光表达,免疫印迹法检测结肠组织Beclin 1、P62和p-m TOR的表达。通过免疫印迹法检测自噬抑制剂巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1,BAF）存在和不存在情况下,结肠组织LC3II的蛋白表达,评估PF对CAC小鼠结肠肿瘤自噬的影响,揭示PF对CAC小鼠预防的作用机制。研究结果1.RPA防治肿瘤的研究现状及发展趋势:虽然近30年来该领域的中文及英文文献总量较低,但年文献数量均有显著增长。以中国为核心的东亚国家在RPA抗肿瘤研究中起着关键作用。国内发文量分布存在地区不平衡性,可能与RPA的产地分布有关。高等学校,尤其是中医院校是该项研究的主要研究力量。国际期刊《Journal of Ethnopharmacol》及中文核心期刊《中草药》、《中国实验方剂学杂志》关注了RPA对肿瘤的研究。关键词分析可见,RPA抗肿瘤研究的热点主要集中在其活性成分PF和凋亡。2.TCMSP数据库检索到RPA的8个活性成分及89个靶蛋白。Cytoscape3.7.2软件构建的“药-靶”互作网络显示靶点数最多的4个活性成分依次是山奈酚（kaempferol,43）,b-谷甾醇（β-sitosterol,35）,PF（4）和（+）-儿茶素（（+）-catechin,3）。Drug Bank、OMIM、Gene Cards数据库检索到1936个CAC相关靶点。Venny2.1.0软件获得41个RPA抗CAC候选靶点。Cytoscape3.7.2软件构建PPI互作网络拓补结构分析显示,IL-6的度大于20。聚类分析显示IL-6、JUN、MAPK8、TNF、STAT1、ICAM、CAT、NOS2、PTGS2所在的节点群评分最高（7.25）。其中,IL-6得分最高。结合网络拓扑结构和聚类分析结果,提示IL-6是RPA抗CAC的核心靶点。RPA抗CAC的候选靶标功能富集于TNF信号通路,Relaxin信号通路,IL-17信号通路,凋亡通路,Toll样受体信号通路,HIF-1信号通路,鞘脂信号通路,NOD样受体信号通路、胰腺癌、Th17细胞分化等癌症相关通路。最后,IL-6与山奈酚、b-谷甾醇,PF和（+）-儿茶素均有良好的对接能力。其中,PF与IL-6的对接分数在四个活性成分中最低。3.经过10 mg/kg的AOM溶液腹腔注射和3个周期浓度为2.5%的DSS饮用联合干预,AOM/DSS组小鼠出现体重减轻、稀便及血便等结肠炎症状。第28d,小鼠结肠可出现不典型增生。随时间推移,第91 d,结肠可见到明显浸润型癌组织,伴有严重的肠道炎症反应,提示AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型成功。在AOM诱导的散发性CRC模型小鼠中,单独腹腔注射10 mg/kg的AOM第210d,小鼠结肠出现明显肿块型CRC。然而,小鼠未出现明显稀便或血便以及结肠组织炎性细胞浸润等结肠炎改变。在DSS诱导的慢性肠炎模型小鼠,单独给予3个周期的2.5%DSS饮用第91 d,小鼠结肠未见到明显的不典型增生。AOM/DSS组小鼠外周血细胞因子IL-6、TNF-a和MIP-3a含量、结肠组织IL-6和IL-17A含量显著高于Blank control组和AOM组（P＜0.05）。药物干预过程中,AOM/DSS+PF（30和60mg/kg）组和AOM/DSS+Aspirin组小鼠存活率和增重率显著高于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）。药物干预结束后,AOM/DSS+PF（30和60mg/kg）组和AOM/DSS+Aspirin组小鼠结肠荷瘤数显著少于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）。AOM/DSS+PF（15、30和60mg/kg）组和AOM/DSS+Aspirin组小鼠结肠荷瘤面积显著小于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）。AOM/DSS+NS组小鼠结肠肿瘤突破粘膜层,呈中分化浸润癌,并伴有严重炎症反应。AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组和AOM/DSS+Aspirin组小鼠结肠肿瘤局限于黏膜层内,呈高级别上皮内瘤样变,肠道炎症评分低于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）。AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组和AOM/DSS+Aspirin组小鼠结肠肿瘤增殖标记物Ki-67和PCNA表达低于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）。肝、肾组织H＆E染色显示AOM/DSS+NS组和AOM/DSS+Aspirin组肝细胞嗜酸性减弱,有轻度水样变。各治疗小组肾组织未见明显结构改变。同时,AOM/DSS+NS组与AOM/DSS+Aspirin组血清ALT/GPT活力较Blank control组增高（P＜0.05）。AOM/DSS+Aspirin组血清CRE、BUN含量较Blank control组增高（P＜0.05）。4.血清细胞因子抗体芯片检测结果显示:与AOM/DSS+NS组相比较,AOM/DSS+PF（15、30和60 mg/kg）组小鼠血清IL-2、IL-13、IL-10、TGF-β1以及IL-12p70水平显著升高（P＜0.05）。AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组血清IL-6、IL-21和MIP-3α水平降低（P＜0.05）,AOM/DSS+PF（60 mg/kg）组血清TNF-α水平降低（P＜0.05）。在结肠肿瘤组织中,AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组IL-6和IL-17A水平显著低于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）,IL-10水平高于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）。RT-PCR结果显示:与AOM/DSS+NS组相比较,AOM/DSS+PF（15、30和60 mg/kg）组及AOM/DSS+Aspirin组结肠肿瘤组织RORγt以及IL-17A m RNA水平降低（P＜0.05）。不同的是,AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组结肠肿瘤组织Foxp3 m RNA水平高于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）。免疫印迹检测结肠肿瘤组织STAT3表达结果显示:AOM/DSS+PF（15、30和60mg/kg）组p-STAT3（Tyr705）表达水平低于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）,STAT3的表达在各治疗组间没有显著差异（P＞0.05）。结肠肿瘤微环境免疫组化检测结果显示:与Blank control组相比较,F4/80以及i NOS在AOM/DSS诱导的CAC小鼠结肠肿瘤组织中表达增加（P＜0.05）。不同浓度（15、30和60 mg/kg）PF处理后,F4/80以及i NOS表达均有所降低（P＜0.05）。TUNEL凋亡检测结果显示AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组凋亡细胞数显著多于AOM/DSS+NS组。免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达结果显示:与AOM/DSS+NS组相比较,AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组结肠肿瘤组织Bax水平增加（P＜0.05）,AOM/DSS+PF（15、30和60 mg/kg）组结肠肿瘤组织Caspase-3水平增加（P＜0.05）。与Bax及Caspase-3表达不同的是,AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组结肠肿瘤组织抗凋亡蛋白Bcl-2表达较AOM/DSS+NS组降低（P＜0.05）。PF对结肠肿瘤组织自噬通量影响的结果显示:在没有自噬抑制剂BAF的条件下,与AOM/DSS+NS组相比较,AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组结肠肿瘤组织LC3II表达水平增加（P＜0.05）。当加入自噬晚期抑制剂BAF后,AOM/DSS+NS组以及PF对结肠肿瘤组织LC3II表达趋势与未加入之前相似。但是,AOM/DSS+NS组小鼠结肠肿瘤组织LC3II的积累未见显著增长,AOM/DSS+PF（15、30和60mg/kg）组结肠肿瘤组织LC3II的积累明显增加。与AOM/DSS+NS组相比较,AOM/DSS+PF（60 mg/kg）组结肠肿瘤组织Beclin 1表达水平增加（P＜0.05）,p-m TOR（Ser 2448）表达水平降低（P＜0.05）。AOM/DSS+PF（30和60 mg/kg）组结肠肿瘤组织P62表达水平低于AOM/DSS+NS组（P＜0.05）。研究结论1.1991-2021年RPA抗肿瘤研究的发文数量不高,但逐年增长。RPA的活性成分PF以及凋亡是该领域研究的热点。2.RPA是一种潜在的抗CAC药,涉及41个CAC靶点及多条信号通路。其活性成分PF能与核心靶标IL-6稳定结合并通过氨基酸残基TYR109、ASP56、LEU46发生相互作用。3.对PF的研究数据支持了其对AOM/DSS诱导CAC小鼠模型的化学预防作用。15-60 mg/kg的PF治疗12周对小鼠肝、肾无明显毒性作用。4.PF通过缓解肠道炎症、抑制IL-6/STAT3信号通路以及调节凋亡、自噬水平发挥对CAC小鼠的预防作用。