论文部分内容阅读
目的:研究缺氧复氧对心肌细胞自噬和线粒体Cx43的影响,探讨自噬与线粒体Cx43在心肌细胞缺氧复氧损伤中的关系及作用。方法:分别对乳鼠原代心肌细胞和H9c2心肌细胞进行培养,根据培养情况最终选择H9c2心肌细胞进行后续实验。通过对H9c2心肌细胞更换为不含血清的低糖DMEM培养基并置于缺氧(5%C02、2%02)培养箱中12h作为缺氧处理,后恢复含血清的高糖DMEM培养基及常氧培养12h作为复氧处理。倒置显微镜观察细胞形态学变化、CCK-8检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测培养液中LDH活性,建立心肌细胞缺氧复氧(H/R)模型。按随机原则将心肌细胞分为五组:对照组、H/R组、格尔德霉素组(GA组)、3-甲基腺嘌呤组(3-MA组)、格尔德霉素+3-甲基腺嘌呤组(GA+3-MA组)。GA处理是在缺氧复氧前先对心肌细胞进行30min的GA(1μmol/L)预处理;3-MA处理是在缺氧复氧同时在培养基中加入3-MA(5mmol/L)进行干预。CCK-8检测细胞存活率,JC-1法检测线粒体膜电位,Western blot测定Beclin-1、LC3B、线粒体Cx43及线粒体磷酸化Cx43(p-Cx43)蛋白水平,电镜观察自噬体情况。结果:1、与对照组相比,H/R组形态学上可见死细胞增多、细胞密度减少,且细胞存活率下降、LDH水平升高(P<0.01),心肌细胞缺氧复氧模型建立成功。2、心肌细胞损伤情况:与对照组相比,H/R组线粒体膜电位、细胞存活率均下降(P<0.05);与H/R组相比,GA组、3-MA组和GA+3-MA组线粒体膜电位、细胞存活率均下降(P<0.05);GA+3-MA组线粒体膜电位、细胞存活率均分别低于GA组和3-MA组(P<0.05)。3、自噬活性检测:与对照组相比,H/R组自噬体增多、自噬相关蛋白Becl in-1水平和LC3BⅡ/LC3B Ⅰ均升高(P<0.05);与H/R组相比,GA组、3-MA组和GA+3-MA组自噬体减少、Beclin-1 水平、LC3BⅡ/LC3B Ⅰ 均下降(P<0.05);GA+3-MA 组 Beclin-1 水平、LC3BⅡ/LC3BⅠ均分别低于GA组和3-MA组(P<0.05)。4、线粒体Cx43蛋白水平:与对照组相比,H/R组线粒体Cx43及p-Cx43含量均下降(P<0.05);与H/R组相比,GA组和GA+3-MA组线粒体Cx43及p-Cx43含量均下降,而3-MA组只有线粒体p-Cx43含量下降(P<0.05);GA+3-MA组线粒体p-Cx43含量分别低于GA组和3-MA组(P<0.05)。结论:缺氧复氧引起心肌细胞自噬上调、线粒体Cx43含量下降以及脱磷酸化增加,其中线粒体含量下降及脱磷酸化增加可能是缺血再灌注损伤发生的重要机制。自噬参与线粒体Cx43磷酸化状态的维持,线粒体Cx43特别是p-Cx43参与自噬的激活过程,它们共同承担着对缺氧复氧心肌的保护作用。靶向上调自噬与线粒体Cx43含量以及改善线粒体Cx43磷酸化状态可能成为以后治疗心肌缺血再灌注损伤的重要手段。