水稻白叶枯病是我国水稻生产中的四大病害之一,主要是由水稻黄单胞杆菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)通过水稻叶片的水孔和伤口侵入并于维管束内大量繁殖和扩展而引起的一种细菌性病害。当前主要通过施加化学农药如叶枯唑、杀枯净等药剂或选育抗性水稻品种的方法。但大量施加化学农药易造成农药残留,生态环境破坏、有益生物被杀等问题。植物内生真菌是指寄生在健康植物茎叶中,但对寄主又形成不明显侵染的一类真菌,其普遍存在于现阶段已研究过的水生植物和陆生植物体内。相对植物体内生物总量而言,内生真菌所占比例虽然微乎其微,但是其在整个农业发展过程中却发挥着举足轻重的作用。除了已被普遍认可的增强植物抗逆性、促进植物生长等作用外,内生真菌还能产生异香豆类、生物碱类、杀虫类、醌类、肽类、酚类等抗菌活性成分物质。而这些抗菌活性物质能特异性地抑制某些病原菌的生长和繁殖速度,从而达到降低农作物病害的目的。因此,现阶段从自然环境中选育一株对水稻白叶枯病菌具有高效拮抗作用的植物内生真菌是防治白叶枯病菌病害的一个重要方向。第一,本实验室从浙江省金华市郊水稻田健康水稻叶片内分离获得一株高效拮抗水稻白叶枯病菌的植物内生真菌Bo-1菌株。经形态特征、ITS rDNA序列分析与比对及系统发育树构建,Bo-1菌株被鉴定为淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca)。生理生化试验结果表明,Bo-1菌株对碳源、氮源的利用没有表现出特别的选择性,并且可以水解明胶、淀粉、尿素、酪蛋白等大分子物质；对外界环境的耐受能力测定,发现Bo-1菌株对酸性和弱碱性环境以及高、低温环境都具有较强的适应能力。第二,选取多种病原菌作为供试菌,测定淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca) Bo-1菌株的抗菌谱。结果表明：Bo-1菌株发酵液乙酸乙酯粗提物对多种细菌类病原体都具有较强拮抗能力,其中对白色念珠菌(Monilia albican, M.. albican)拮抗力最大,抑菌圈直径达38.9mm。以Xoo作为指示菌,测定淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca) Bo-1菌株乙酸乙酯提取物抑菌稳定性。试验结果表明,Bo-1菌株的乙酸乙酯提取物抑菌活性随着温度的升高而降低,121℃时抑菌圈直径降至17.6mm：随着酸碱性增强,抑菌活性均呈逐步下降趋势,但在pH2.5和pH10.5下依然保持较高抑菌活性；对于紫外光40W或普通光源4000lx光照处理,其保持了稳定的抑菌能力。第三,采用单因素试验测定Bo-1菌产抗菌物质培养所需的最佳碳源、氮源、无机盐并通过正交试验对其培养基配方和摇瓶发酵条件进行优化。研究结果表明,Bo-1菌产抗菌物质最佳碳、氮源和无机盐分别为淀粉、蛋白胨、MgSO47H2O;最佳培养基配方：淀粉30g/L,蛋白胨2g/L,MgSO47H2O0.5g/L；最佳发酵条件为：温度30℃,转速150r/min,装液量80mL/250mL, pH6.5。第四,盆栽试验,测定淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca) Bo-1菌株乙酸乙酯提取物水溶液对水稻白叶枯病的生防效果。采用人工剪叶法侵染4种感病水稻品种,并分别用方法1(先喷药后接种P6菌)、方法2(先接种P6菌后喷药)、方法3(只接种P6菌)、无菌水空白对照组共4种不同方法处理水稻叶片。试验结果表明,水稻叶片病斑抑制率最高达到86.38%,病情指数最大下降了41.62%,防效作用最大达59.67%。此外,比对试验中所采用的3种方法不难发现,方法1的防治效果明显优于其他两种方法,而方法1主要侧重于预防。由上可知,在防治水稻白叶枯病过程中,采取预防手段更为重要。第五,以Xoo P6生理小种作为指示菌进行活性跟踪,通过分步萃取、硅胶柱层析、高效液相色谱等步骤,分离纯化获得拮抗活性物质结晶,对目标物进行核磁共振氢谱分析和质谱分析,通过解析与比对,该物质分子量为344.0835,分子式为C18H1607,鉴定为松萝酸(usnic acid)。将纯化的松萝酸以3%中生菌素和20%叶枯唑为对照,采用96孔板法测定对Xoo P6生理小种的拮抗活性,最低抑制浓度(MIC值)为200μg/mL,表明松萝酸具有较强的抑菌活性,但较中生菌素弱,与20%叶枯唑效果相近。