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研究背景:细菌治疗癌症起于19世纪,Coley医生观察到一些感染丹毒的肉瘤患者病情缓解的病例,由于当时抗生素未出现,丹毒不容易控制,且不容易诱导,Coley医生不能有效使用活菌,因此他使用灭活的细菌产物去治疗病人,然而这种方法有效性仅局限于少数病人,即不能用其他方法治疗的肉瘤患者。后来随着放化疗的出现,有极大局限性的细菌治疗的方法被逐渐忽视。数年后,人们发现癌症患者长期生存率及控制率并没有较好改善,于是逐渐又对细菌治疗癌症燃起了希望。为了扩大细菌治疗疫苗的适应症,人们逐渐改造细菌疫苗,例如通过基因工程改造细菌,使其具有特殊的性状,或是使用减毒的活细菌疫苗。改良后的细菌疗法治疗癌症拥有其他治疗不能企及的优点:特异性靶向肿瘤。铜绿假单胞菌-甘露糖敏感血凝菌(PA-MSHA)是牟希亚建立的经过改造的铜绿假单胞菌,菌体周边布满Ⅰ型菌毛。其借助免疫源性强的Ⅰ型菌毛,在体内能提高细胞免疫和体液免疫:包括增强NK细胞的杀伤性,提高T淋巴细胞数量及改变T淋巴细胞亚群比例关系,增加抗PA-MSHA抗体。PA-MSHA在临床上主要用作免疫调节剂,并作为肿瘤病人的辅助治疗,激活免疫系统杀伤肿瘤。PA-MSHA具有较强的对于肿瘤细胞的细胞毒性,实验发现PA-MSHA细胞毒性的原因是通过抑制EGFR信号通路实现的,而参阅文献发现PA-MSHA电镜下存在于细胞内部,因此本实验探讨PA-MSHA对舌鳞癌细胞杀伤作用及机制,并探讨PA-MSHA对舌鳞癌细胞系自噬的影响。目的:1.研究PA-MSHA对舌鳞癌细胞系CAL-27、SCC-15的杀伤作用及机制。2.探讨PA-MSHA对舌鳞癌细胞系CAL-27、SCC-15自噬的影响。3.探讨PA-MSHA对舌鳞癌细胞系CAL-27、SCC-15 TLR通路的影响。方法:1.用PA-MSHA处理舌鳞癌细胞株,观察细胞形态改变,CCK8、LDH检测药物对舌鳞癌细胞的活性及毒性影响。2.PA-MSHA处理舌鳞癌细胞株,用Hoechst33258染色检测核形态。3.PA-MSHA处理舌鳞癌细胞株,Annexin-V/PI染色,流式细胞术检测凋亡。4.RT-q PCR检测PA-MSHA处理后的舌鳞癌细胞株Caspase相关蛋白酶m RNA表达变化5.western blot检测PA-MSHA处理后的舌鳞癌细胞株Caspase相关蛋白酶表达变化。6.用氯喹、巴弗洛霉素A1处理舌鳞癌细胞株,CCK8检测药物的安全剂量。7.RT-q PCR检测PA-MSHA处理后的舌鳞癌细胞株TLR9、IFR7 m RNA表达变化。8.western blot检测PA-MSHA处理后的舌鳞癌细胞株LC3、p62相关蛋白的表达量的变化。结果:1.PA-MSHA杀伤舌鳞癌细胞株,并呈剂量依赖性。2.PA-MSHA诱导舌鳞癌细胞凋亡。3.PA-MSHA促使舌鳞癌细胞株Bcl-2家族中Bax表达升高,增加Caspase被剪切。4.对于本实验中的舌鳞癌细胞株,BAF用于抑制自噬溶酶体的饱和工作浓度为25n M。5.PA-MSHA能影响舌鳞癌细胞自噬的水平。6.舌鳞癌细胞株CAL-27、SCC-15表达TLR-9,PA-MSHA能激活SCC-15细胞株TLR9受体的My D88依赖的干扰素产生途径,且能促进CAL-27、SCC-15EGFR m RNA表达升高。结论:PA-MSHA通过线粒体-Caspase机制杀伤舌鳞癌细胞株CAL-27、SCC-15,并且能改变细胞自噬水平,激活TLR9受体。