背景:　　近年来，众多学者通过尝试体外构建组织工程化软骨以修复软骨缺损，获得了较为满意的效果。种子细胞（软骨细胞）是构建组织工程软骨的首要因素，体外培养时如何解决其表型改变、去分化，受到了众多研究者的关注。威灵仙作为“祛风湿、除痹痛”之要药，具备中药多靶点、多基因的作用特点。我们前期的研究显示，威灵仙能够促进体外软骨细胞增殖及TGF-β1 mRNA的表达，关节腔注射威灵仙联合可注射性壳聚糖/β-甘油磷酸二钠胶复合软骨细胞移植可较好地修复软骨缺损，但也发现即使在威灵仙作用下，体外平面培养软骨细胞增殖能力仍较低，对密度高度依赖，易发生老化现象。为改变这一现状，我们联想到了低强度脉冲超声(LIPUS)技术，设想通过LIPUS改善软骨细胞膜的通透性，促进威灵仙的药物传递，试图提高威灵仙对软骨细胞的生物学效应。同时基于前期的研究基础及TGF-β1在软骨形成过程中的调控作用，我们推测:在威灵仙的基础干预下，施加适当的LIPUS辐照，可有效提升威灵仙对软骨细胞生物学活性的调控，而这种效应可能是通过促进TGF-β1信号的转导而实现的。　　目的:　　进一步明确中药威灵仙干预体外培养软骨细胞的最佳效应浓度，探讨LIPUS是否能够促进威灵仙的药物传递，提高其对软骨细胞的生物学效应，明确LIPUS协同增效的最佳作用参数，分析二者协同增效的可能作用机制，寻找威灵仙刺激软骨细胞的可能作用靶点。　　方法:　　(1)取2周龄健康新西兰白兔，以膝关节为关节软骨取材部位，采用机械分离及Ⅱ型胶原酶消化法，分离培养兔膝关节软骨细胞，采用Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色及甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞，倒置显微镜下定期观察软骨细胞的形态学变化，根据其生长情况，及时调整培养条件，建立处于最佳状态的软骨细胞库。　　(2)取处于对数生长期第2代软骨细胞，随机分为五组，分别加入单纯的含10％FBS的LG-DMEM培养基及含质量浓度分别为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1 mg/ml、0.5mg/ml的威灵仙培养基，分别于培养后24h、48h、72h，采用CCK-8比色法分析各组软骨细胞的增殖情况。　　(3)取处于对数生长期第2代软骨细胞，随机分为四组，除空白对照组外，其他三组给予不同强度(40mW/cm2、60mW/cm2、80mW/cm2)的LIPUS辐照，基本参数为中心频率(F0):1MHz，脉冲重复频率(PRF):1kHz，脉冲宽度200μs，作用周期(Cycle):50，作用时间(Time):20min/d，连续辐照3d后，采用CCK-8比色法分析各组软骨细胞的增殖情况。　　(4)取第2代软骨细胞，随机分为四组，即空白对照组、威灵仙组、LIPUS组、LIPUS介导威灵仙组，其中威灵仙的干预浓度及LIPUS的辐照参数均为前述实验筛选出的最佳参数，基本处理方式同方法(2)、(3)，其中空白对照组、威灵仙组的细胞培养皿每日需静置于超声探头下20min，但不施加超声刺激。干预3d后，采用CCK-8比色法检测软骨细胞的增殖情况，免疫细胞化学、Western blot及荧光定量PCR法检测软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白及mRNA的表达情况。　　(5)取第2代软骨细胞，随机分为四组，即空白对照组、威灵仙组、LIPUS组、LIPUS介导威灵仙组，各组处理方式同方法(4)，干预3d后，检测各组软骨细胞TGF-β1蛋白及mRNA的表达情况;取第2代软骨细胞，随机分为四组，即空白对照组、TGF-β1组、LIPUS介导威灵仙组、LIPUS+威灵仙+TGF-β1中和抗体组，其中TGF-β1的作用浓度为0.5ng/ml，TGF-β1中和抗体的作用浓度为10μg/ml，其余处理同方法(4)，干预结束后检测各组软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白及mRNA的表达情况;取第2代软骨细胞，随机分为四组，即空白对照组、威灵仙组、TGF-β1组、LIPUS介导威灵仙组，各组处理措施同前，干预结束后检测各组软骨细胞TGFβRⅡ、Smad2、Smad7及Smurf2等蛋白及mRNA的表达情况。　　结果:　　(1)镜下观察，分离所得的软骨细胞24h后多数贴壁，伸出突起，外观呈多角形或不规则状，培养3～4d后，细胞数量明显增多，成簇分布的地方呈现“铺路石”样外观，前3代软骨细胞增殖速度较快，至第4代之后，增殖速度明显放缓，外观呈现长梭形，去分化明显，生长周期延长。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色见胞浆中棕黄色颗粒阳性表达，甲苯胺蓝染色后见细胞外基质中蓝色异染颗粒，而细胞核呈现深蓝色。　　(2)干预24h后，威灵仙对软骨细胞增殖无明显影响(P=0.232)，干预48h、72h后，不同质量浓度的威灵仙均可促进体外关节软骨细胞的增殖，明显优于空白对照组(P＜0.01)，且0.1mg/ml威灵仙组软骨细胞增殖效应最为显著，高于0.01、0.05、0.5mg/ml威灵仙组，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　(3)在基本参数相同的情况下，40、60、80 mW/cm2LIPUS均可显著促进体外软骨细胞的增殖，且效应均优于非LIPUS辐照(P＜0.05)，而60 mW/cm2LIPUS组软骨细胞增殖最为显著，OD值明显高于40、80 mW/cm2LIPUS组，差异具有统计学意义(P=0.003、0.049)。　　(4)在0.1mg/ml威灵仙作用的基础上，施加强度为60 mW/cm2LIPUS辐照，其可协同促进体外培养软骨细胞的增殖，效应要优于单纯的威灵仙或LIPUS的刺激作用，差异有统计学意义(P=0.000、0.009)，但此协同效应要小于威灵仙及LIPUS二者效应之和;参数优化后的威灵仙、LIPUS以及LIPUS联合威灵仙均能促进软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白及mRNA的表达，与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01），在Ⅱ型胶原蛋白及mRNA水平上，LIPUS联合威灵仙的效应均优于单纯的威灵仙或LIPUS的作用(P＜0.01)。　　(5)参数优化后的威灵仙、LIPUS以及LIPUS联合威灵仙均能促进软骨细胞TGF-β1蛋白及mRNA的表达，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，且在LIPUS辐照后，威灵仙促进软骨细胞TGF-β1蛋白及mRNA表达的能力增强，差异有统计学意义(P＜0.05)。在加入TGF-β1中和抗体后，LIPUS介导威灵仙促进软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白及mRNA表达的能力有所下降，差异存在统计学意义(P＜0.01)，但仍都高于单纯培养基的作用(P＜0.05);威灵仙、TGF-β1以及LIPUS介导威灵仙均能显著促进关节软骨细胞TGFβRⅡ、Smad2蛋白及mRNA的表达(P＜0.05)，下调Smad7、Smurf2mRNA的表达水平(P＜0.01)，在TGFβRⅡ、Smad2蛋白及mRNA、Smad7mRNA水平上，LIPUS介导威灵仙的效应要优于威灵仙及TGF-β1的作用(P＜0.05)，而在Smurf2mRNA水平上，LIPUS介导威灵仙与单纯的威灵仙及TGF-β1无明显差异(P=0.624、0.257)。　　结论:　　(1)取2周龄幼兔，以膝关节为关节软骨取材部位，采用机械分离和Ⅱ型胶原酶消化法可以成功分离关节软骨细胞，且实验选用培养3代以内的软骨细胞较为理想。　　(2)威灵仙提取物能够促进兔软骨细胞的增殖，其增殖效应与药物浓度有关，在0.01～0.1 mg/ml范围内，其促软骨细胞增殖效应与浓度呈现正相关，且在0.1mg/ml时达到高峰。　　(3) LIPUS在一定程度上模拟了软骨细胞体内生存的微坏境，能够促进关节软骨细胞增殖，且增殖效应与LIPUS的刺激强度密切相关，当强度为60mW/cm2时其促软骨细胞增殖的作用较为明显。　　(4)0.1mg/ml的威灵仙及强度60mW/cm2、20min/d的LIPUS可协同促进体外培养兔关节软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原蛋白及mRNA的表达，且整体效应要优于单纯的威灵仙或LIPUS的刺激作用。　　(5)威灵仙、LIPUS以及LIPUS联合威灵仙均能促进兔关节软骨细胞TGF-β1蛋白及mRNA的表达，且LIPUS辐照可协同增强威灵仙促进软骨细胞表达TGF-β1，且TGF-β1在两者协同促进软骨细胞增殖及基质分泌的过程中起着重要的调节作用。　　(6) LIPUS介导威灵仙可能通过提高TGF-β/Smads信号通路中TGF-β1、TGFβRⅡ、Smad2分子的表达，下调Smad7、Smurf2分子的表达，从而促进该信号通路的转导，起到促进软骨形成的作用。而且，软骨细胞内的TGF-β1、TGFβRⅡ、Smad2、Smad7、Smurf2等功能分子蛋白及基因的变化可能是骨关节炎等软骨退变、软骨损伤发病的重要机制之一。