论文部分内容阅读
脂肪组织中的甘油三酯在维持机体能量平衡过程中起着重要的作用。它的水解是一系列有序调控的过程,在不同的过程中有不同的酶参与。新近发现的脂肪酶ATGL特异性地水解甘油三酯,是甘油三酯水解的主要限速酶。同时它与游离脂肪酸的浓度、葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性紧密相关。因此,它的表达调控很受关注。脂肪细胞因子leptin可以提高脂肪细胞的脂肪分解,诸多现象表明,ATGL在leptin调控脂解过程中可能发挥着重要的作用。但ATGL在leptin促脂解过程中的表达变化及其机理至今还没有被直接和系统地研究。因此,本实验以与人类生理生化等方面最为相似的猪为模式动物,采用RT-PCR、细胞培养、甘油和FFA释放量测定、半定量RT-PCR、Western Blot等方法克隆了猪ATGL的全长CDS,研究了ATGL在leptin促脂解中的表达变化,并初步探讨了其机理。取得以下主要结果:1成功克隆了猪ATGL基因全长CDS,长度为1446 bp,GenBank登陆号为EU373817。与GenBank已发表的人和小鼠的ATGL基因进行序列比对,同源性分别为87%和82%,这说明猪ATGL基因与人和小鼠在核苷酸水平有较高的同源性,暗示他们之间具有相似的功能和表达调控。猪ATGL基因全长CDS的克隆为研究ATGL在leptin促脂解过程中的表达变化奠定了一定的基础。2明确了leptin呈浓度依赖性促进猪脂肪细胞的脂解。与对照组相比,5、20和50 ng/mL的Leptin均可显著促进甘油的释放( P< 0.01),并且leptin呈浓度依赖性促进甘油的释放,其中促进甘油最大释放的浓度为50 ng/mL;而与对照组相比,5、20和50 ng/mL的leptin均可降低FFA的释放,但差异不显著( P>0.05)。3从体内和体外两个水平研究了ATGL mRNA和蛋白在leptin介导脂解过程中的表达调控,首次发现了在leptin介导脂解的过程中, ATGL mRNA表达升高的同时却伴随ATGL蛋白表达的下降。在体外猪脂肪细胞上的研究表明,ATGL mRNA的表达随着leptin浓度的增加不断升高,而ATGL的蛋白却不断降低;在活体皮下脂肪组织上的研究表明,ATGL mRNA和蛋白的表达与血清中leptin的水平密切相关,高水平的leptin伴随ATGL mRNA的高表达,但同时伴随ATGL蛋白的低表达。4初步研究了ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达调控机理,发现了ATGL在leptin介导脂解中的表达受到JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路和PPARγ的共同调控。JAK-STAT信号通路和MAPK信号通路的特异性抑制剂AG490和SB205380分别使ATGL mRNA的表达下调35.02%和23.26%,但与对照组相比,都显著提高ATGL蛋白的表达;PPARγ的特异性抑制剂GW9662和激动剂rosiglitazone分别使ATGL mRNA的表达上调9.16%和下调18.26%,并相应地使ATGL蛋白表达显著下调和上调。