B-RAF基因及MAPK信号转导通路和胃癌相关性及其机制的研究前言对肿瘤(癌)发生机制和防治的研究，多年来一直是人们关注和研究的热点问题。肿瘤的发生和侵袭转移是涉及许多基因参与的、多途经和多步骤的发展过程。其中，癌基因控制机体细胞的生长和分化，重要的癌基因激活可引起肿瘤的发生。癌基因B-RAF属于RAF基因家族，编码丝氨酸/苏氨酸激酶，是有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路中的重要成员之一。近年来的研究发现许多肿瘤中存在B-RAF基因突变，尤其是黑色素瘤和甲状腺癌中B-RAF基因突变率高达60～80％，突变主要集中于B-RAF基因的第11和第15外显子，这说明B-RAF基因与黑色素瘤和甲状腺癌有关。到目前为止国内外有关B-RAF基因在胃癌发生、发展中的机制研究尚未见报道。我们在前期工作中利用基因芯片技术对胃癌发病不同阶段的基因表达进行了较为全面、动态的研究。我们发现B-RAF基因在癌旁、癌及淋巴结转移癌中表达与正常胃粘膜组织相比均有明显升高，提示B-RAF基因可能是胃癌发生过程中的一个重要基因。因此我们首先对150例人胃癌组织标本中B-RAF基因突变热点第11和第15外显子进行突变筛查，结果显示阴性；但同时的免疫组化以及Western Blot结果却显示胃癌组织中B-RAF蛋白表达阳性，而癌旁组织中无B-RAF蛋白表达，这说明B-RAF基因与胃癌有相关性，但B-RAF基因在胃癌中的作用机制可能不同于黑色素瘤和甲状腺癌。为了深入探讨B-RAF基因在胃癌发生、发展中的可能作用，阐明B-RAF基因及MAPK信号转导通路和胃癌的相关性及其机制，以及B-RAF基因的上游调控基因，我们首先应用RNA干扰技术抑制胃癌BGC823细胞中B-RAF基因的表达，分析B-RAF基因对胃癌BGC823细胞生物学特性的影响；其次利用免疫沉淀(IP)技术结合蛋白质的质谱分析研究B-RAF蛋白在胃癌细胞中发挥作用时可能与之结合的未知蛋白；最后应用GGTI-298和FTI-277分别抑制RAS和RAPl蛋白活性以及利用生物信息学软件预测并用染色质免疫沉淀(CHIP)结合PCR技术研究B-RAF基因的上游调控基因。本研究对阐明B-RAF基因及MAPK信号转导通路与胃癌相关性以及对B-RAF基因在胃癌发生中调控机制研究具有重要意义。方法应用PCR-DHPLC结合DNA测序技术筛查B-RAF基因点突变；免疫组化和Western Blot检测胃癌组织中B-RAF蛋白表达。针对B-RAF基因和RelA基因设计siRNA，体外转录合成B-RAF-siRNA和RelA-siRNA，利用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将其分别转染胃癌细胞系BGC823细胞。RT-PCR和Western Blot检测胃癌BGC823细胞中B-RAF基因和RelA基因的表达；MTT、流式细胞术、Transwell和RT-PCR以及Western Blot分别检测B-RAF基因和RelA基因表达抑制后对胃癌细胞系BGC823细胞生物学特性的影响以及分子机制；免疫沉淀技术结合蛋白质的质谱分析技术研究可能与B-RAF蛋白结合的未知蛋白；利用GGTI-298和FTI-277处理胃癌细胞系BGC823细胞，Western Blot检测二种抑制剂对胃癌细胞中B-RAF基因表达的影响；利用生物信息学转录因子预测软件预测可能与B-RAF基因上游启动子区特异序列结合的转录因子，并用染色质免疫沉淀技术结合PCR技术对生物信息学转录因子预测软件预测的结果进行验证。结果1．人胃癌组织中B-RAF基因突变筛查结果：在150例人胃癌组织和癌旁组织标本中未筛查到B-RAF基因第11外显子和第15外显子存在突变。2．人胃癌组织中B-RAF蛋白表达分析：免疫组化结果显示在20例人胃癌组织标本中，胃癌细胞中可见棕色颗粒，主要分布于细胞质，B-RAY蛋白表达阳性，而正常胃腺细胞中未见棕色颗粒，B-RAF蛋白表达阴性。3．B-RAF-siRNA对胃癌细胞中B-RAF mRNA表达的影响：B-RAF-siRNA转染BGC823细胞第5和第7天时B-RAF mRNA表达水平可见到明显变化，B-RAF-siRNA组较对照组B-RAF mRNA表达水平明显降低。4．B-RAF-siRNA对胃癌细胞中B-RAF蛋白表达的影响：B-RAF-siRNA转染BGC823细胞第9天时B-RAF蛋白表达水平可见到明显变化，B-RAF-siRNA组较对照组B-RAF蛋白表达水平明显降低，表明B-RAF蛋白表达受到抑制。5．B-RAF-siRNA对人胃癌BGC823细胞生长的影响与细胞对照组相比，B-RAF-siRNA对体外培养的胃癌BGC823细胞的生长有明显抑制作用。其中，转染后72h抑制率达20％。6．B-RAF-siRNA对胃癌细胞凋亡的影响B-RAF-siRNA组胃癌BGC823细胞凋亡率为19.58％，B-RAF-siRNA组较对照组胃癌BGC823细胞凋亡率明显升高，说明B-RAF基因抑制能够引起胃癌BGC823细胞凋亡。7．B-RAF-siRNA抑制人胃癌BGC823细胞中BCL-2 mRNA的表达。8．B-RAF-siRNA对细胞侵袭力的影响B-RAF-siRNA转染后第9天，细胞侵袭力明显降低。9．RAP1抑制剂GGTI-298和RAS抑制剂FTI-277均明显抑制胃癌BGC823细胞中B-RAF mRNA和蛋白的表达。10．RelA-siRNA对胃癌BGC823细胞中B-RAF蛋白表达的影响RelA-siRNA有效地抑制RelA基因表达后，胃癌BGC823细胞中B-RAF蛋白表达水平也明显降低。11．免疫沉淀技术结合质谱分析结果胃癌BGC823细胞中B-RAF蛋白可能与PR02619蛋白结合。12．染色质免疫沉淀技术结合PCR技术检测结果在NF-κB抗体免疫沉淀的DNA片断中含有B-RAF基因的启动子区NF-κB蛋白的结合序列。结论1．B-RAF基因点突变可能不是B-RAF基因参与胃癌发生的途径。2．B-RAF基因表达增高可能与胃癌发生密切相关。3．B-RAF基因是与胃癌相关的重要癌基因，促进胃癌细胞的生长增殖、抑制细胞凋亡和增强胃癌细胞的侵袭力。4．BCL-2基因在胃癌细胞中可能位于B-RAF基因的下游并受其调控。5．B-RAF基因在其信号转导通路中受RAPI和RAS上游基因的双重调控；6．RAP1和RAS的抑制剂GGTI-298与FTI-277可抑制胃癌细胞的增殖，促进胃癌细胞的凋亡；7．NF-κB可能是调控B-RAF基因的重要转录因子8．B-RAF蛋白在胃癌BGC823细胞中可能与PR02619蛋白结合。