米非司酮是一种人工合成的19-去甲基睾酮衍生物,具有抗孕激素和糖皮质激素作用。从首次合成米非司酮以来,米非司酮已被广泛用作抗早孕治疗,并成功用于紧急避孕。多年来的基础和临床研究表明,米非司酮在妇产科学、内分泌学、肿瘤学及免疫学等多个领域表现出一定的应用潜力。米非司酮作为孕激素受体调节剂,是目前药物流产的常规用药。近年的研究表明,低剂量的米非司酮具有"内膜避孕"作用,然而其作用的免疫学机制却并不清楚。树突状细胞(dendriticcells,DCs)是目前已知的机体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞。吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是细胞内的一种催化色氨酸分子沿犬尿酸途径进行分解代谢的限速酶。IDO主要表达在树突状细胞,在维持早期妊娠中发挥重要作用。IDO+tC能够抑制T细胞活化与增殖,促进T细胞的凋亡,诱导调节性T细胞的产生。因此,在本研究中我们选用外周血树突状细胞为研究对象,就上述疑问探讨米非司酮对树突状细胞分化和功能的调节及其可能的作用机制。在本研究结合体外实验,从细胞水平,利用Western blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Real-time RT-PCR及流式细胞检测等相关技术,探讨米非司酮在胚胎植入过程中对母胎界面获得性免疫的调节及机理,为新避孕途径的开发以及人类的生殖过程中相关疾病发生机理和治疗研究提供新的思路。第一部分米非司酮对DCs诱导分化的调节作用目的:分选外周血树突状细胞(Dendritic cells,DCs),以 20 nmol/L,65 nmol/L,200 nmol/L米非司酮(Mifepristone,Ru486)分别作用于DCs,观察米非司酮对DCs成熟及生物学功能的影响,探讨米非司酮在胚胎植入过程中对母胎界面获得性免疫的调节及机理。方法:人外周血CD14+单核细胞在体外经GM-CSF、IL-4培养6天诱导分化为未成熟DCs。加入不同剂量的米非司酮(20 nmol/L,65 nmol/L,200 nmol/L)继续培养48小时,同时设置溶剂对照组(加入米非司酮溶剂dimethyl sulphoxide,DMSO)。流式细胞仪检测和分析细胞表面CD80、CD86和ICAM-I分子的表达情况。酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbnent assay,ELISA)检测 DCs 培养上清液中IL-12p70水平。结果:1.米非司酮上调DCs表面CD80及CD86和ICAM-I分子表达。2.与对照组相比,米非司酮处理组DCs分泌的IL-12p70水平显著升高(P<0.05)。在一定范围内(65nmol/L～200nmol/L),米非司酮促进DCs分泌IL一 12p70的能力随着米非司酮浓度增大而增强。结论:1.米非司酮诱导DCs表型成熟,促进DCs分泌IL-12。2.在一定浓度范围内,米非司酮对DCs的促成熟作用存在量效关系。3.米非司酮可能通过促进DCs成熟,引发母体对半同种异体胎儿抗原免疫排斥,达到抗着床避孕。第二部分米非司酮在DCs对获得性T细胞免疫应答的调节中的作用目的:通过检测DCs对调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)Foxp3表达和IL-10分泌的影响,研究米非司酮在DCs对获得性T细胞免疫应答的调节中的作用。方法:将不同剂量米非司酮处理后DCs分别与Tregs混合培养,蛋白印迹法(Western blot)检测forkheadboxp3(FOXP3)的表达,ELISA检测混合培养上清中IL-10的表达。结果:未成熟DCs分别经20,65,200 nM米非司酮,DMSO溶剂处理后用作刺激细胞,同种异体Tregs用作反应细胞。采用Western blot检测FOXP3蛋白水平。我们发现,200nmol/L米非司酮组,FOXP3蛋白表达较对照组低(0.25±0.03 vs.0.62±0.01;P<.01),也较 65nmol/L 米非司酮组低(0.25±0.03 vs.0.34±0.01;P<.01)。对照组和20nmol/L米非司酮组间没有明显差异。同时,我们采用ELISA检测上清液中IL-10的表达。65nmol/L和200nmol/L组IL-10表达降低,IL-10的变化和FOXP3蛋白水平的变化是一致的。IL-10表达在对照组,20nmol/L米非酮组,65nmol/L米非司酮组和200nmol/L米非司酮组分别为:171.25±7.85,158.34±9.46,127.36±6.37 和 109.2±9.45。结论:经米非司酮处理后的DCs抑制Tregs表达FOXP3和IL-10。这提示米非司酮在DCs对获得性T细胞免疫应答的调节中发挥作用。第三部分IDO在米非司酮影响DCs功能中的作用目的:1.通过检测米非司酮对吲哚胺-2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)表达及其活性的影响。2.探讨IDO在米非司酮影响DCs功能中的作用。方法:1.人外周血CD14+单核细胞在体外经GM-CSF、IL-4培养6天诱导分化为未成熟DCs。加入不同剂量的米非司酮(20nmol/L,65nmol/L,200nmol/L)继续培养48小时,同时设置溶剂对照组(加入米非司酮溶剂DMSO)。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IDO mRNA的表达;Western blot检测IDO蛋白的表达;高效液相色谱法(HPLC)检测色氨酸(Trp)及其特异代谢产物犬尿氨酸(Kyn)的浓度,以判断IDO活性。2.人外周血CD14+单核细胞在体外经GM-CSF、IL-4培养6天诱导分化为未成熟DCs。加入200nmol/L继续培养48小时,将培养后的成熟DCs分为2组:加入1 ng/ml 1-甲基-色氨酸(1-methyl tryptophan,1-MT)培养者为组2,未加入1 ng/ml 1-MT 者为组 1,每组 1.0 × 106/mlDCs。加入 1-MT10 小时后,和 Tregs(1.0× 105/ml)在6孔板中混合培养5天。western-blotthe检测foxp3蛋白的表达;ELISA检测上清中IL-10的表达。结果:1、米非司酮处理后的DCs的IDO的表达和活性采用Real-time RT-PCR检测IDO mRNA在DCs的表达。IDOmRNA表达在对照组,20nmol/L米非司酮组,65nmol/L米非司酮组和200nmol/L米非司酮组分别为:1,0.86±0.12,0.69±0.08 和 0.52 ±0.05。IDO mRNA 在树突状细胞的表达在65和200 nmol/L米非司酮组较对照组低(P<.01)。65和200 mnol/L组间下调IDO呈剂量依赖性(P<.05)。对照组和20 nmol/L米非司酮组间没有明显差异(P>.05)。采用Western blot检测IDO蛋白水平和采用Real-time RT-PCR检测的IDO mRNA水平是一致的。IDO蛋白表达在对照组,20nmol/L米非司酮组,65nmol/L米非司酮组和200nmol/L米非司酮组分别为:0.94 ± 0.10,0.75 ± 0.11,0.67± 0.07 和 0.42 ± 0.23。为了评价IDO活性,我们用高效液相色谱法检测Kyn/Trp比例。Kyn/Trp比例水平和IDO mRNA和蛋白水平一致。IDO活性在20nmol/L米非司酮组,65nmol/L米非司酮组和200nmol/L米非司酮组分别为1.39 ± 0.03,0.62 ± 0.01,0.12 士 0.02,对照组为 1.42 士 0.03。2、IDO抑制剂1-MT处理后FOXP3和IL-10的表达加入1-MT后,IDO 作用受抑制,FOXP3表达升高(0.12±0.01 vs.2.21±0.16.P<0.01);Tregs 分泌 IL-10 升高(106.47±11.58 vs.327.01±15.95 P<0.01)。结论米非司酮降低DCs中IDOmRNA及蛋白的表达,降低IDO酶活性;IDO抑制剂1-MT可逆转米非司酮处理后的DCs抑制Tregs表达FOXP3和IL-10,提示低剂量米非司酮通过降低IDO调节DCs功能。这可能是米非司酮避孕的免疫学机制。