目的:牙周炎是由牙菌斑引起的感染性疾病,会导致牙齿支持组织破坏、牙周袋形成、附着丧失和牙槽骨吸收,最终会导致牙齿脱落,是影响人们健康的常见病、多发病。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromnas gingivalis,P.gingivalis）是一种无芽孢的革兰氏阴性产黑色素专性厌氧杆菌,是慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势菌之一。P.gingivlalis能够诱导宿主细胞发生异常免疫反应,破坏宿主与微生物之间的平衡,导致宿主体内和谐共生的微生物组出现生态失调。P.gingivalis的毒力和潜在致病作用多种多样,细菌本身及其代谢产物入血经血液途径可到达机体不同的器官,诱发或加重多种全身系统性疾病。生理状态下,肠道稳态的维持有赖于肠道微生物、肠道上皮系统和免疫系统三者之间的相互作用。肠道菌群失调可引起宿主免疫应答的活化,打破易感宿主的免疫耐受,继而引发全身免疫失衡,最终出现促炎性应答,导致外周组织破坏。炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一组累及回肠、直肠、结肠甚至全消化道的慢性非特异性肠道炎性疾病,是肠道疾病中最多发的疾病之一,主要包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。UC 的发病机制是环境因素、肠道微生物、遗传易感性以及免疫因素等多种因素间复杂作用的结果,免疫调节紊乱是其发病的关键因素。研究表明肠道黏膜免疫反应的激活是导致UC发生、发展和转归的直接原因之一。人体T细胞来源于胸腺,根据表型不同可分为CD4+和CD8+两大细胞亚群。在受到抗原刺激后,抗原呈递细胞及其分泌的细胞因子可诱导CD4+T细胞分化为Th1、Th2、Th17和调节性T淋巴细胞（Tregs）等。白细胞介素-17（interleukin-17,IL-17）是Th17细胞分泌的主要效应分子,Th17细胞与类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、银屑病、UC等自身免疫性疾病均相关。UC患者的肠黏膜在炎症状态下具有较高水平的Th17和IL-17,且UC患者在活动期Th17主要表达于肠黏膜的固有层。Th17和IL-17可能是UC的发病机制中重要的调节因子之一。Tregs通过抑制Th1和Th17细胞产生的促炎性细胞因子,与疾病进展和免疫炎性反应的降低密切相关。Th17细胞和Tregs在由葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate,DSS）诱导的结肠炎中起着至关重要的作用。Th17细胞通过IL-17的依赖性方式,刺激炎性浸润活化和结肠粘膜的弥漫性出血,加速隐窝脓肿的形成,加速UC恶化。Tregs由于促进抗炎性细胞因子TGF-β和IL-10的产生,抑制了 Th17细胞的扩散,进而抑制结肠炎的发展,在UC中是主要的免疫抑制细胞。牙周炎患者的口腔细菌可与肠道微生物群一起转移到肠道,影响肠道微生物群的平衡,导致肠上皮通透性增加和内毒素血症的增加,加重肠道炎症。有研究表明,牙周炎可通过微生物群和免疫异常反应两种机制促进结肠炎的进展,口腔微生物群在肠道中的异位定植,可诱导肠道中的Th17细胞发生免疫异常反应。在由结扎丝诱导的大鼠牙周炎模型中发现小肠上皮分层、基底层变性、隐窝加深和中性粒细胞浸润等结构改变。补充肠道益生菌可以缓解这些缺陷。由牙龈卟啉单胞菌引起的口腔感染会削弱结肠运动功能,这意味着牙周致病菌可以被称为IBD的宿主反应调节剂。在口腔中产生并激活的局部促炎性细胞因子,可进入血液并循环至肠道,从而影响IBD。同时,与健康对照者相比,UC患者的牙周炎发病率显著增高,牙周袋深度更深,牙齿缺失数更多。这些证据表明,牙周炎与结肠炎密切相关。肽酰精氨酸脱亚氨酶（peptidylarginine deiminase,PAD）是一种蛋白质修饰酶,参与许多重要的生理过程,包括细胞分化,免疫应答和基因转录。PAD能够通过催化肽酰精氨酸残基转变为瓜氨酸残基,修饰宿主蛋白,将其转化为瓜氨酸。蛋白质瓜的氨酸化通过改变蛋白质的结构和功能,改变趋化因子的免疫活性,引起宿主免疫异常反应,从而导致多种炎症性疾病,如系统性红斑狼疮,类风湿性关节炎,阿尔茨海默氏病和UC等。在先天免疫应答的初始阶段,瓜氨酸刺激嗜中性粒细胞和巨噬细胞活化,促进肠道炎症的进展和加重。通过对IBD患者的结肠组织活检发现,瓜氨酸化表达明显高于对照组。在由DSS诱导的UC动物模型的肠道固有层细胞中发现,PAD染色较强,瓜氨酸化可以促进炎症。牙龈卟啉单胞菌肽精氨酸脱亚氨酶（Porphyromonas gingivalis peptidylarginine deiminase,PPAD）是口腔细菌中唯一由P.gingivalis分泌的生物酶,在外膜囊泡中合成和释放,能够加速牙龈组织中的蛋白质瓜氨酸化,由PG1424基因编码。根据前人研究及本课题组研究结果提示,PPAD可能是研究P.gingivalis乃至牙周炎与自身免疫性疾病相关关系潜在机制的重要因子之一,但PPAD是否有助于UC尚未明确。本研究拟通过基因敲除技术构建PG1424基因突变菌株和回补株,为研究PPAD的功能提供研究基础。通过DSS建立UC小鼠动物模型,研究PPAD在肠道疾病中免疫应答反应的作用,探讨PPAD能否对UC的严重程度产生影响。同时通过体外细胞学研究,将P.gingivalis W83野生菌株和ΔPG1424菌株分别与CD4+T细胞共培养,检测Th17细胞和Tregs的百分比,以及上清液中IL-17和IL-10的表达水平,验证P.gingivalis能否通过促进CD4+T细胞向促炎性Th17细胞转化,促进炎症性免疫反应,从而加重UC的严重程度。研究方法:1、构建PG1424基因的同源重组载体,将载体电转化至P.gingivalis W83菌株。外源插入基因为红霉素抗性基因,具备红霉素抗性,可通过红霉素抗性培养基筛选阳性菌株。通过realtime PCR等方法鉴定,为研究PG1424基因功能提供细菌模型。2、选取C57BL/6小鼠30只随机分成5组,每组6只。第一组:对照组,正常饮食饮水40天;第二组:P.gingivllis组,正常饮食饮水40天,从第1天起隔天喂饲1×109CFU/mL P.gingivalis W83 至第 40 天;第三组:肠炎组,正常饮食饮水40天,从第31天起饮水中加入DSS药物建造UC模型10天;第四组:肠炎野生株组,正常饮食饮水40天,从第1天起隔天喂饲1×109CFU/mL P.gingivalis W83至第40天,从第31天起饮水中加入DSS药物建造UC模型10天;第五组:肠炎突变株组,正常饮食饮水40天,从第1天起隔天喂饲1×109 CFU/mL△PG1424至第40天,从第31天起饮水中加入DSS药物建造UC模型10天。实验期间每日观察小鼠一般情况,称量体重,计算疾病活动指数和组织损伤指数,评估结肠炎严重程度。全部小鼠于实验第40天结束时处死取材,如遇中途死亡情况则立即取材。外周血采集方式采用摘除眼球取血,分离血清,并采用颈椎脱位法处死,分离结肠,观察结肠状态并测量结肠长度,结肠组织HE染色做组织病理学切片检查。采用流式细胞术和ELISA试剂盒法对外周静脉血进行Th17细胞和Tregs百分比检测,对IL-17和IL-10表达水平进行检测。3、通过体外细胞学研究,将P.gingivalis W83和PG1424基因突变菌株分别与CD4+T细胞共培养72h后,检测Th17细胞和Tregs的百分比,IL-17和IL-10的表达水平,探讨P.W83能否通过促进CD4+T细胞向促炎性Th17转化,进一步促进炎症性免疫反应,从而加重UC的发生、发展。结果:1、构建PG1424基因的同源重组载体,电转化至P.gingivalis W83菌株后,插入外源基因使PG1424基因失活。经红霉素抗性培养基筛选阳性菌株,通过realtime PCR方法鉴定后证实PG1424基因失活菌株构建成功。2、饮用DSS溶液的三组小鼠体重下降明显,结肠长度缩短,肠腔内大量积血。DAI指数、组织损伤指数及组织病理学结果均显示炎性改变较重,Th17细胞分选的比例和血清中IL-17的含量显著升高,Tregs比例和IL-10含量显著降低,且肠炎野生株组的各项结果与肠炎组和肠炎突变株组相比较,可见显著性差异。肠炎组和肠炎突变株组之间各项结果比较未见显著性差异。P.gingivalis组与对照组相比,虽然各项结果略高于对照组,但未见显著性差异。3、通过体外细胞学实验发现,P.gingivalis W83菌株与ΔPG1424均能促进CD4+T细胞向促炎性Th17转化,以及Th17的主要效应性细胞因子IL-17的表达上调,Tregs 比例和IL-10表达含量均下降。与ΔPG1424之间比较,P.gingivalis W83菌株促进CD4+T细胞向促炎性Th17转化和IL-17表达上调的作用更明显,两者之间比较有显著性差异。结论:1、P.gingivalis能够加重UC的严重程度,并可能是肠道疾病的危险因素之一。2、与ΔPG1424相比较,感染P.gingivalis W83菌株的小鼠UC严重程度更为明显,提示我们PPAD可能是P.gingivalis W83菌株诱导CD4+T细胞向促炎性Th17转化,促进UC的炎症反应,加重UC严重程度的潜在机制。3、PPAD在CD4+T细胞向Th17的转化过程中发挥着重要作用,从而加重UC的严重程度,对PPAD的深入研究为探讨UC免疫异常反应的相关因素提供了新的研究方向。