一、研究背景：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target Of Rapamycin, mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白质激酶,大环内酯类药物雷帕霉素(rapamycin)可特异性抑制mTOR。作为细胞内多种生理活动的中心调控分子,mTOR可接受并整合细胞内外的各种刺激如激素、生长因子、营养、能量、缺氧、应激等,调节蛋白质翻译、细胞生长、增殖、存活、自噬、迁移、血管形成等生理过程。人类一系列重大疾病如癌症、心血管疾病、移植排斥及自体免疫紊乱、糖尿病、肥胖、神经系统疾病等均涉及mTOR信号的失调,mTOR信号通路成为近年生命科学领域的研究热点。mTOR在细胞内通过与其它分子形成复合物发挥其生物学活性,目前认为主要有两种复合mTORC1(mTOR complex1)和mTORC2(mTOR comp-lex2)。mTORCl由mTOR、Raptor (regulatory-associated protein of mTOR)和LST8/GβL (G protein unit-like protein)组成,能接受激素、生长因子、营养及能量、应激等刺激并对rapamycin敏感。生长因子、胰岛素等可通过与受体结合并活化肌醇三磷酸激酶(PI-3K),后者通过PI-3K依赖的激酶1(PDK1)激活蛋白激酶B(PKB/Akt)。激活的Akt可磷酸化结节性硬化复合物2(tuberous sclerosis complex2,TSC2)并减弱其对小G蛋白Rheb的抑制作用。活化的Rheb则激活mTORC1. mTORC1下游的直接底物为S6K1(p70S6kinase)和4E-BP1(eIF4E binding protein1)。前者被mTOR磷酸化(T389)激活后可通过磷酸化核糖体蛋白S6促进核糖体的发生,后者磷酸化后活性被抑制,不能再结合并抑制真核细胞翻译起始因子eIF4E从而促进cap依赖的翻译,两者共同促进蛋白质合成。mTORC1还存在负反馈调控：S6K1的活化可抑制胰岛素受体底物1(IRS1)从而负反馈调控Akt/mTORC1。mTORC2包括nTOR、mLST8/GβL、Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR)和Sinl(SAPK interacting protein1)等。Sinl与Rictor是mTORC2特有的亚单位。mTORC2对Rapamycin不敏感,可被生长因子激活,但机制还不清楚。目前认为其主要功能是作为Akt的激酶磷酸化Akt(S473),在PKB/Akt的激活中起重要作用。此外,mTORC2在细胞生存、代谢、增值和骨架重组中具有重要作用。另外,mTORC2还与蛋白激酶C-a(proein kinase C-a), PKCa(S657)磷酸化及细胞骨架重组的调节有关。但相对于mTORC1, mTORC2的调节机制目前还很不清楚。IKK (IkB kinase, IkB激酶)/NFkB是介导炎症反应的主要信号通路。IKK是由IKKα、IKKβ和IKKγ/NEMO三个亚基组成的蛋白复合物,其中IKKα、IKKβ是催化亚基,IKKy/NEMO是调节亚基。IKK可被TNFα、IL1、LPS等刺激活化,介导炎症反应、免疫应答等过程。IKKβ在乳腺癌、前列腺癌、大肠癌、肝癌等多种肿瘤组织中也被广泛激活,且激活程度与其恶性程度成正相关,表明IKK对于肿瘤的发生发展具有重要作用。调控肿瘤发生发展主要通过两种途径：其一,通过依赖NFkB的途径。IKK是NFkB信号通路的关键分子,它的作用是磷酸化IκB,使其发生泛素化降解,而促使NFkB发生核转位,进而调节转录；其二,通过不依赖NFkB的途径。最近研究发现,IKK可通过磷酸化并抑制TSC1来激活mTORC1,从而促进血管表皮生长因子(VEGF)的合成与肿瘤血管形成。还有报道mTORC1是IKK的上游,它通过其成员Raptor与IKK相互作用可以调节NFkB活性。因此,炎症反应可通过IKK与mTORC1这两条关键信号通路之间的相互作用调节细胞生长与肿瘤发生。然而IKK是否可以调节mTORC2信号,目前没有报道。二、目的：研究IKK对mTORC2的调节作用及其分子机制。本实验通过HEK293、MCF-7和NIH3T3等细胞系研究IKK与mTORC2特有成员Rictor的相互作用及其对mTORC2信号通路影响的研究,以建立新的IKK与mTOR信号之间的联系与相互作用(crosstalk),为mTOR信号调节机制和IKK、mTORC2相关疾病的发病机理提供新内容和药物研究提供新的靶点选择。三、研究方法：实验主要是将不同的细胞系通过各种方法抑制(抑制剂、siRNA及激酶失活型质粒)或者激活(野生型及活化型质粒)IKK信号,检测对mTORC2下游Akt (S473)磷酸化和细胞骨架的影响。还通过免疫共沉淀的方法检测外源性及内源性IKK与Rictor之间的相互作用,这种相互作用受IKK活性状态(抑制或激活)的影响,IKK与Rictor之间的相互作用影响了mTORC2的组装(Rictor与mTOR之间的相互作用)及mTORC1的组装(Raptor与mTOR之间的相互作用),其证实了IKK是通过与Rictor相互作用影响mTORC2的组装从而调节mTORC2。四、研究结果1、IKK对mTORC2信号的调节IKK是否能与mTORC2相互作用并调节mTORC2信号,目前是没有报道的。我们通过免疫共沉淀实验发现,在HEK293和MCF-7细胞中,内源性与过表达的IKKa和IKKp与内源性或过表达的Rictor都具有相互作用。为了更进一步的精确rictor的那一部分结构域与IKKα和IKKβ有相互作用,以及是否为直接作用,我们将Rictor分为五个片段Rictor1-5(氨基酸1-398；氨基酸335-733；氨基酸667-1067；氨基酸999-1397；氨基酸1323-1708),并通过GST-pulldown实验结果证明：IKKa和IKKp与GST-Rictor4(999-1397aa)具有直接相互作用。2、IKK抑制剂可抑制(?)mTORC2的活性我们进一步探讨了IKK是否影响mTORC2的活性。结果发现IKK的抑制剂Bayll-7082在一些细胞内(NIH3T3、HEK293、HEK293T)可显著抑制P-Akt(S473)的水平,并且具有一定的时间和剂量依赖性。体外激酶活性检测实验也证明Bayll-7082可抑制mTORC2的激酶活性。这一结果提示IKK可能正调节mTORC2磷酸化Akt(S473)的活性。3、IKK的siRNA能抑制mTORC2的活性我们继续使用IKKα和IKKβ的siRNA干扰敲低IKKa和IKKβ的表达,用以更进一步的验证IKK对mTORC2活性的调节。IKKa和IKKβ的水平下调后P-Akt(S473)水平具有明显的下调。4、IKK与PKC的磷酸化水平和细胞骨架重组有关有研究表明mTORC2可通过调节PKCa的磷酸化水平控制细胞骨架重组的功能。通过这些研究,我们考虑IKK是否可以影响PKCa(S657)的磷酸化和细胞骨架的形成。因此,我们用IKK的抑制剂Bayl1-7082处理NIH3T3细胞,发现P-PKCa(S657)的磷酸化被抑制。未经处理的细胞内,微丝呈正常分布,聚集在细胞边缘,即细胞质中。通过用IKK的抑制剂Bay11-7082、IKK的siRNA处理和过表达无激酶活性(dominant negative, DN)的IKK突变体DN-IKK-α、DN-IKK-β,微丝成束状分布于细胞中央。这些结果表明,IKK可以调节mTORC2细胞骨架重组功能和PKC的磷酸化。5、IKK作用于胰岛素介导的mTORC2的信号有文献报道,mTORC2可以被很多生长因子激活,如胰岛素。为了判断IKK是否作用于胰岛素介导的mTORC2信号,我们用IKK的特异性抑制剂Bayl1-7082处理血清饥饿24h的NIH3T3和MCF-7细胞发现P-Akt(S473)水平也可被Bayl1-7082完全抑制。由此可说明IKK也可调节胰岛素介导的mTORC2通路。6、IKK可调节Rictor与mTOR相互作用为了更进一步了解IKK怎样调节mTORC2的,我们首先检测了IKK是否能影响Rictor与mTOR的相互作用。当细胞用IKK抑制剂Bayl1-7082处理或转染DN-IKKβ后,发现IKK可影响Rictor与mTOR的相互作用。然而,对Raptor与mTOR的相互作用没有影响,仅对Raptor具有微弱的下调。另有以往研究报道,mTORC2的活性可被Rictor(Thr1135)的磷酸化负反馈激活。因此,我们用IKK的抑制剂Bay11-7082作用于HEK293细胞,发现Rictor(Thr1135)的磷酸化可被IKK的抑制剂Bay11-7082所抑制的,并且呈现一定的时间和剂量的依赖；同时其对P-Akt(S473)的抑制作用也呈现时间和剂量的依赖。因此,IKK的抑制剂对P-Akt(S473)的抑制作用与其抑制P-Rictor(Thr1135)无关。mTOR的Ser2481位点是一个自身磷酸化位点,mTOR该位点的磷酸化是mTORC2复合物完整性的标志。mTOR的Ser2448磷酸化位点则由S6K(p70)激活,并主要发生在mTORCl。然而,我们的实验中发现,P-mTOR(S2481)和P-mTOR(S2448)可被IKK的抑制剂Bay11-7082所抑制。P-mTOR(S2481)被IKK抑制剂所抑制表明IKK活性对nTORC2组装很关键。P-mTOR(S2448)的抑制可能是IKK可抑制mTORC1/P-S6K所引起的。这些证据提示,IKK可通过调节mTORC2组装调节mTORC2活性。五、结论：综上所诉,IKK可通过与Rictor直接相互作用,调节mTORC2的组装与mTORC2的活性和功能。这一研究结果建立了一条新的IKK与nTORC2信号之间的相互作用,为mTOR言号通路的调节机制提供新内容,为IKK、mTORC2信号相关疾病的研究药物研究提供了新的靶点选择。