论文部分内容阅读
第一部分高脂喂养对ApoE-KO小鼠认知功能的影响及7,8-DHF对其认知功能的保护作用及机制研究 目的：研究高脂喂养下ApoE-KO小鼠是否存在认知功能障碍及7,8-DHF的干预研究 方法：本实验分为三组：取10只C57BL/6雄性、4周龄小鼠作为正常组。20只雄性、4周龄 ApoE-KO小鼠随机分为两组：认知功能障碍组、7,8-DHF干预组（自造模开始予7,8-DHF干预25周，灌胃，5mg/kg/d）。以上三组均于适应性喂养一周后（5周龄）开始高脂饮食喂养。25周后，采用水迷宫试验评估各组小鼠空间学习和记忆能力；Western blot法检测各组小鼠海马中 BDNF和 p-TrkB/TrkB表达水平，海马和皮质中 p-AKT/AKT、p-GSK/GSK、tauS396、PHF1、AEP、tauN368表达水平；免疫荧光法检测海马中tauN368表达情况。 结果：在水迷宫行为学实验中，从第二天开始，认知功能障碍组的潜伏期(escape latency)明显长于正常组（P<0.05）。从第四天开始，认知功能障碍组的潜伏期开始明显长于干预组（P<0.05）。在第六天撤去平台后，认知功能障碍组穿越平台次数(crossing time)、目的象限游泳时间及游泳距离所占比例(time and distance in NE quadrant)均少于或低于干预组和正常组小鼠，差异有统计学意义（P<0.05）。同时，五天水迷宫行为学实验中，正常组和干预组表现无明显差异（P>0.05）。Western blot法提示各组小鼠海马中：BDNF表达各组无明显差异（P>0.05）；而干预组p-TrkB/TrkB、p-AKT/AKT以及p-GSK/GSK的表达水平均高于正常组（P<0.05）;干预组 p-GSK/GSK蛋白表达水平高于认知功能障碍组（P<0.05）;对 active-AEP和 tauN368表达水平检测中，认知功能障碍组的表达均高于正常组和干预组（P<0.05）；干预组 tauS396的表达水平显著低于认知功能障碍组（P<0.05）；干预组 PHF1表达水平，明显低于认知功能障碍组和正常组（P<0.05）。在各组小鼠皮质中，干预组 p-AKT/AKT以及p-GSK/GSK的表达水平均高于认知功能障碍组（P<0.05）；同时，认知功能障碍组PHF1的表达水平高于干预组（P<0.05）；和其他两组相比，active-AEP表达水平以认知功能障碍组最高，差异具有统计学意义（P<0.05），而干预组和正常组相比也有明显升高（P<0.05）；对于 tauN368的表达，正常组则明显低于其他两组。在小鼠海马的免疫荧光检测中，认知障碍组海马组织中 tauN368表达水平较正常组和干预组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论：长时间的高脂喂养会导致 ApoE-KO小鼠的认知功能障碍，并且，该认知功能障碍可能与 active-AEP所切割的异常 tauN368片段有关。长时间的7,8-DHF干预可以改善高脂喂养下 ApoE-KO小鼠的认知功能，可能是通过激活AKT/GSK通路、抑制磷酸化tauS396的表达以及PHF1的表达从而发挥保护作用。并且，在7,8-DHF干预下，active-AEP表达量的减少，抑制了异常切割片段tauN368的生成，从而发挥保护作用。 第二部分血管性认知功能障碍新型模型的构建 目的：本研究旨在构建符合临床特征的血管性认知功能障碍模型并分析该模型中异常tau蛋白的表达水平。 方法：本实验分为三组：取30只ApoE-KO雄性、4周龄小鼠，随机分为假手术组(sham group)、单侧鞘管置入术组(unilateral implantation of shear stress modifier group; USSM)、双侧鞘管置入术组(bilateral implantation of shear stress modifier group; BSSM)，每组10只。各组小鼠适应性喂养1周后，在手术前4周以高脂喂养，术后继续高脂喂养8周（即在17-18周龄时进行行为学检测）。随后采用水迷宫行为学实验评估各组小鼠空间学习和记忆能力；采用MRI影像学评估有无新/旧梗死灶产生；对比各组小鼠血脂情况；Western blot法检测各组小鼠海马中 p-AKT/AKT、p-GSK/GSK、tauS396、PHF1、AEP、tauN368表达水平；免疫荧光法检测海马中tauN368表达水平。 结果：在水迷宫试验中，BSSM组小鼠第4、5天潜伏期较假手术组明显延长(P<0.05），并且，在第6天，假手术组小鼠在目标象限的游泳时间和游泳距离明显高于其他两组（P<0.05）。在MRI检测中（包括T2WI和DWI），各组小鼠未见陈旧性/新鲜缺血病灶。在对各组小鼠 Western blot检测中：和其他两组相比， BSSM组小鼠海马中 p-AKT/AKT、p-GSK/GSK3β的表达水平明显升高。同时，发现 BSSM组小鼠海马组织中 p-tauS396/tauS396、PHF1、tauN368片段和活化的 AEP表达水平较其他两组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化也提示，同其他两组相比，tauN368在BSSM小鼠海马中表达水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论：本实验中设计的 BSSM模型通过产生颈总动脉动脉粥样硬化，可以模拟临床血管性认知功能障碍，同时，Western blot提示该认知功能障碍可能与异常tau蛋白的表达水平升高有关。