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对于哺乳动物而言,在去负荷和高应激压力条件下,如长期不活动、卧床、失重、缺氧和低温等,较易发生骨骼肌萎缩和肌肉质量减少。然而,同样处于长期不活动叠加低体温等高应激条件下的冬眠哺乳动物,特别是小型冬眠哺乳动物,在历经长达数月的冬眠不活动期后,没有或仅有很小程度的肌肉萎缩和肌肉质量的降低。在冬眠长时间不活动状态下,小型冬眠哺乳动物通过何种机制避免了肌肉萎缩的发生?对此机制的探讨不仅可为冬眠动物的生理适应机制增加新的有价值的科学资料,还有望为人类废用性肌萎缩的防治提供新思路。关于骨骼肌萎缩的发生机制,一般认为,骨骼肌细胞中蛋白质合成过程受到抑制,而蛋白质降解过程得以增强,导致肌肉细胞蛋白质含量减少,这是导致肌肉萎缩和肌肉质量减少的主要原因和表现。PI3K/AKT/mTOR信号通路在调节细胞周期中起着至关重要的作用,在调节胞内蛋白质合成方面亦扮演着重要的角色。mTOR通过调节骨骼肌合成代谢与分解代谢的信号传导,可以控制骨骼肌的肥大与萎缩。已有的研究和我们之前的成果已经证实,mTOR在维持冬眠动物骨骼肌质量中具有重要作用。因此,通过对PI3K/AKT/mTOR信号通路活性的调节,实现肌细胞内蛋白质合成与降解的平衡,可能是冬眠哺乳动物在冬眠期维持骨骼肌质量的重要机制。PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性受许多信号分子及多条途径的调节。MicroRNA(miRNAs)是一类内源性的非编码小RNA分子,在胞内蛋白表达的转录后调节中起作用。近年来已有研究证实某些miRNAs作为必要的转录后调节因子,可影响骨骼肌胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性。基于以上分析,我们提出假设,miRNAs可能参与了冬眠哺乳动物骨骼肌细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路活性的调节,从而在冬眠期避免骨骼肌发生萎缩中起重要作用。目标:(1)在冬眠期哺乳动物骨骼肌细胞内寻找参与调节PI3K/AKT/mTOR信号通路的miRNAs分子,并检测其在冬眠不同时期表达水平的变化。(2)探讨miRNAs通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,以调节冬眠期哺乳动物骨骼肌蛋白的合成,从而避免骨骼肌萎缩的可能机制。方法:(1)将达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)(一种冬眠啮齿动物)分为六组,分别为夏季活跃组(Summer active group,SA)、冬眠前组(Pre-hibernation group,PRE)、早期冬眠组(Early torpor group,ET)、晚期冬眠组(Late torpor group,LT)、阵间觉醒组(Interbout arousal group,IBA)和出眠组(Post-hibernation group,POST)。每组6只。(2)取各组达乌尔黄鼠后肢中的半腱肌(semitendinosus,ST)作为研究对象。(3)根据基因组数据库和已有文献,选取了在哺乳动物骨骼肌中表达且对PI3K/AKT/mTOR信号通路有调控作用的四个miRNAs,即miR-206、miR-29b、miR-21a和miR-99b。通过Real time-PCR技术测定各组黄鼠半腱肌中四个miRNAs的表达水平。(4)通过Western Blotting技术测定各组黄鼠半腱肌中PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达水平。结果:(1)黄鼠体重变化:夏季活跃组黄鼠体重为270.67±36.84 g。冬眠前黄鼠体重为304.30±59.31 g,升高了12%(P>0.05)。而在经历两个月的冬眠后,黄鼠体重较冬眠前自身体重显著下降,其中早期冬眠组下降22%(P<0.01),晚期冬眠组下降36%(P<0.01),阵间觉醒组下降33%(P<0.05)。至出眠时,黄鼠体重已较冬眠前自身体重下降49%(P<0.001)。(2)半腱肌湿重变化:夏季活跃组黄鼠半腱肌湿重为0.339±0.051 g。冬眠前半腱肌湿重为0.374±0.023 g,升高了10%(P>0.05)。而在经历两个月的冬眠后,黄鼠半腱肌湿重较冬眠前显著下降,其中早期冬眠组下降10%(P<0.05),晚期冬眠组下降15%(P<0.01),阵间觉醒组下降22%(P<0.01)。至出眠时,黄鼠半腱肌湿重较冬眠前下降28%(P<0.001)。(3)各组达乌尔黄鼠半腱肌中miRNAs表达水平的变化:a)miR-206在冬眠前组、早期冬眠组、晚期冬眠组、阵间觉醒组和出眠组中的表达水平较夏季活跃组分别增加了69%(P<0.001)、21%(P<0.05)、15%(P>0.05)、58%(P<0.001)和98%(P<0.001)。与冬眠前组相比,早期冬眠组、晚期冬眠组和阵间觉醒组的表达水平分别降低了28%(P<0.05)、32%(P<0.05)和7%(P>0.05),而出眠组则增加了17%(P<0.05)。b)miR-29b在冬眠前组、早期冬眠组、晚期冬眠组、阵间觉醒组和出眠组中的表达水平较夏季活跃组分别增加了157%(P<0.001)、36%(P<0.05)、5%(P>0.05)、94%(P<0.01)和178%(P<0.001)。与冬眠前组相比,早期冬眠组、晚期冬眠组和阵间觉醒组中的表达水平分别降低了47%(P<0.001)、59%(P<0.001)和25%(P<0.01),而出眠组则增加了8%(P>0.05)。c)miR-21a在冬眠前组、早期冬眠组、晚期冬眠组、阵间觉醒组和出眠组中的表达水平较夏季活跃组分别降低了13%(P>0.05)、64%(P<0.001)、62%(P<0.001)、36%(P<0.01)和37%(P<0.01)。与冬眠前组相比,早期冬眠组、晚期冬眠组、阵间觉醒组和出眠组中的表达水平分别降低了59%(P<0.001)、56%(P<0.001)、26%(P>0.05)和28%(P>0.05)。d)miR-99b的表达水平在各组中无明显变化。其在冬眠前组、晚期冬眠组和阵间觉醒组中的表达水平较夏季活跃组分别增加了15%(P>0.05)、6%(P>0.05)和18%(P>0.05),而在早期冬眠组和出眠组中的表达水平较夏季活跃组分别降低了10%(P>0.05)和15%(P>0.05)。与冬眠前组相比,早期冬眠组、晚期冬眠组和出眠组中的表达水平分别降低了22%(P>0.05)、8%(P>0.05)和26%(P>0.05),而在阵间觉醒组中的表达水平较冬眠前组则升高了3%(P>0.05)。(4)各组达乌尔黄鼠半腱肌中PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达水平的变化:a)PI3K蛋白的表达水平在各组中无明显变化。较夏季活跃组,其在冬眠前组、早期冬眠组和出眠组中的表达水平分别降低了13%(P>0.05)、7%(P>0.05)和4%(P>0.05),而在晚期冬眠组和阵间觉醒组中的表达水平较夏季活跃组分别增加了3%(P>0.05)和10%(P>0.05)。与冬眠前组相比,早期冬眠组、晚期冬眠组、阵间觉醒组和出眠组中的表达水平分别增加了7%(P>0.05)、18%(P>0.05)、26%(P>0.05)和10%(P>0.05)。b)AKT蛋白在冬眠前组、早期冬眠组、晚期冬眠组、阵间觉醒组和出眠组中的表达水平较夏季活跃组分别增加了60%(P<0.001)、22%(P>0.05)、17%(P>0.05)、73%(P<0.01)和87%(P<0.001)。与冬眠前组相比,早期冬眠组和晚期冬眠组中的表达水平分别降低了24%(P<0.05)和27%(P<0.05),而在阵间觉醒组和出眠组中的表达水平分别提高了8%(P>0.05)和17%(P<0.05)。c)mTOR蛋白在冬眠前组、早期冬眠组、晚期冬眠组、阵间觉醒组和出眠组中的表达水平较夏季活跃组分别增加了123%(P<0.001)、69%(P<0.01)、18%(P<0.05)、135%(P<0.001)和100%(P<0.001)。与冬眠前组相比,早期冬眠组、晚期冬眠组和出眠组中的表达水平分别降低了24%(P<0.05)、47%(P<0.01)和10%(P>0.05),而在阵间觉醒组中的表达水平提高了5%(P>0.05)。讨论:(1)PI3K/AKT/mTOR信号通路是胞内上调蛋白质合成的重要信号传导途径之一。本研究的结果表明:a)达乌尔黄鼠半腱肌中mTOR蛋白的表达水平在冬眠前最高,随后在整个冬眠过程中虽然有所降低,但仍高于夏季活跃时。骨骼肌胞内mTOR表达水平的增加,可加强胞内蛋白质的合成。冬眠前与冬眠中mTOR处于较高水平,显然有利于促进蛋白合成,从而补偿由冬眠不活跃引起的骨骼肌蛋白质损失。因此mTOR表达水平的提高可能是防止冬眠期骨骼肌萎缩的重要机制。b)AKT蛋白的表达水平在冬眠前已较夏季活跃时略有升高,随后在整个冬眠过程中持续升高,至出眠时已显著高于夏季活跃时。AKT蛋白作为mTOR蛋白的上游,其表达水平的升高可促进mTOR蛋白的表达。因此冬眠过程中较高水平的AKT,可能是保持mTOR蛋白一直处于较高水平的保障。c)PI3K蛋白是AKT/mTOR信号通路的上游分子。在本研究中,PI3K蛋白的表达水平在各个时期并无明显变化。这提示我们,PI3K可能并未参与冬眠期对AKT/mTOR信号通路的调控,可能是其它信号分子促进了冬眠期间AKT和mTOR表达的上调。(2)在本研究中所选定的miRNAs,miR-206、miR-29b,miR-21a和miR-99b均对PI3K/AKT/mTOR信号通路具有上调效应。本研究的结果表明:在冬眠期间,miR-206和miR-29b的表达水平均较夏季活跃时显著增加;miR-99b的表达水平虽较夏季活跃时有所升高,但无显著性差异;而miR-21a的表达水平出现降低或无显著变化。a)miR-206是一种骨骼肌特异表达的miRNAs。该miRNAs可促进其下游PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性。我们的结果显示miR-206在冬眠期各组达乌尔黄鼠的半腱肌中均高度表达。这表明该miRNAs可能是冬眠期对PI3K/AKT/mTOR信号通路有着重要作用的上调因子。b)miR-29b已被证明是骨骼肌中上调PI3K/AKT/mTOR信号通路的miRNAs之一。miR-29b在冬眠中的高表达,表明miR-29b可能亦参与了冬眠期对PI3K/AKT/mTOR通路的上调。c)miR-21a是一种肌源性的miRNAs,参与骨骼肌的发育,并通过靶向TGFβI基因/蛋白来调节PI3K/AKT/mTOR信号通路。在冬眠各阶段中,miR-21a的表达水平出现降低或无显著变化,这表明冬眠期间,miR-21a可能并未参与PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控。d)miR-99b可以上调PI3K/AKT/mTOR信号通路的蛋白表达。但miR-99b的表达水平在整个冬眠期间并未发生明显变化。这亦表明冬眠期间,miR-99b可能并未参与对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控。结论:本研究首次探讨了miRNAs参与冬眠动物抗骨骼肌萎缩的可能机制,揭示了miRNAs在冬眠期动物骨骼肌维持中的重要作用。PI3K/AKT/mTOR信号通路是动物骨骼肌细胞内调控蛋白质合成与降解平衡的关键调控因子,本研究探讨了冬眠不同时期半腱肌内此信号通路的蛋白表达变化,同时选取了已知对此信号通路有调控作用的四个miRNAs分子(miR-206、miR-29b,miR-21a和miR-99b),测定了各miRNAs在冬眠不同时期半腱肌内的表达。研究结果表明在冬眠过程中,miRNAs(miR-206和miR-29b)可能通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路,增强骨骼肌胞内蛋白合成,从而参与了冬眠过程中骨骼肌的维持,减少了冬眠期骨骼肌质量的丢失。