米曲霉氧化甾醇结合蛋白OSBP5的功能研究

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米曲霉(Aspergillus oryzae)是酿造传统酱油和酒类的安全菌株,是一种丝状真菌,在亚洲广泛用于饮料和传统食品的生产,如清酒,酱油已经有上千年的研究历史,虽然已经在2005年完成了全基因组的测序,但是我们对它的了解仅仅局限于基因序列,还有很多重要的基因功能有待研究和发掘。为了更好地开发和利用米曲霉作为高效的异源表达菌株,提高生产效率,节约成本,相关基因功能的研究显得尤为重要。氧化甾醇结合蛋白(OSBP)是一类存在于真核生物体内的保守蛋白,在脂质和糖代谢、蛋白激酶信号转导、甾体生成、细胞粘附、迁移和增殖等方面均有功能。到目前为止,还没有关于米曲霉氧化甾醇结合蛋白(OSBP)的研究报道。本研究以米曲霉3.042的氧化甾醇结合蛋白为研究对象,主要进行了下面四个方面的研究:1.通过构建cDNA文库,PCR扩增获得目的基因OSBP5,构建米曲霉氧化甾醇结合蛋白OSBP5的原核表达载体,进行转化大肠杆菌DE3感受态,得到原核表达菌株,经IPTG诱导表达后在体外纯化出蛋白质。通过制作标准蛋白曲线,测定出纯化蛋白的浓度。根据蛋白浓度计算所需各种配体的浓度,利用微量热涌动技术,检测了该蛋白质在体外与麦角甾醇、胆固醇、β甾醇、豆甾醇和七-酮基胆固醇等不同甾醇的结合KD值,分析其在体外表达的蛋白活性以及与体外不同甾醇的结合情况。2.PCR从cDNA文库中得到目的基因,过表达载体选在pEX2B,干扰载体选择PEX1成功构建米曲霉氧化甾醇结合蛋白OSBP5的过表达和干扰载体,并利用原生质体转化法,转入米曲霉3.042尿嘧啶缺陷型菌株,通过筛选成功得到过表达菌株和干扰菌株各五株,利用RT-PCR法,进行荧光定量,分别得到表达量最低和最高的菌株#4和#11的表型变化。分析OSBP5基因在不同时间,不同温度,不同乙醇浓度的表达模式。3.将得到的过表达菌株#11和干扰菌株#4以及对照菌株送去广州基迪奥公司进行测序,首先分析所提取的RNA的质量,得到可信数据分析差异基因表达后发现差异基因集中分布在各个代谢通路上,表明OSBP5与米曲霉的与脂肪酸代谢密切相关。4.将得到的两株菌株进行皂化处理后,利用高效液相谱法检测菌丝体内麦角甾醇含量变化,发现过表达和干扰后的米曲霉菌株的菌丝体内麦角甾醇含量都会上升,揭示了OSBP5基因在米曲霉内可能与甾醇转运相关的基因功能。5.NCBI获得目的基因的碱基序列,BLAST比对得到蛋白序列,利用SPRING预测可能与该蛋白发生相互作用的蛋白,预测得到五种蛋白,并将编码蛋白的基因扩增,并成功构建表达载体。利用酵母双杂技术转化酵母AH109菌株,探索基因在米曲霉脂类运输功能的作用模式。
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