家蚕是鳞翅目的模式昆虫。家蚕的血液承担着许多重要的生理机能，是内环境中重要的组成部分，通过消化吸收的营养物质和体内分泌的激素等，大多通过血液运输到各组织细胞中，维持蚕体的基础代谢和生长发育。家蚕血液是中间代谢的场所，其蛋白质的变化将有效揭示家蚕生理和病理的变化机制。在羽化这一变态的重要时期，其生理结构发生了巨大的变化，而这些变化是靠血液中一些重要的蛋白来参与完成的。蚕蛾不摄取食物，蚕蛾的运动和交配都需要储藏蛋白和转运蛋白来提供能量和输送能量，而且许多成虫特有的生物学行为的调控也要靠血液中的小分子蛋白来实现。家蚕血液蛋白质组研究处于刚起步阶段，目前国内外有关报道不多。本研究在实验室对家蚕蛋白质组的研究基础上，利用双向电泳和质谱手段，鉴定出了血液中一些与羽化相关的重要蛋白。利用比较蛋白质组学手段通过图象扫描和计算机软件分析找出了羽化前后双向电泳图谱的差异蛋白，并利用质谱技术对这些差异蛋白进行鉴定，然后采用生物信息学的手段和核酸水平上的研究再对蛾期高表达的ApolipophorinⅢ蛋白的功能进行了初步研究。主要包括以下内容：1．家蚕羽化前后血液蛋白的双向电泳及质谱鉴定：利用双向电泳技术构建了本实验室家蚕羽化前后血液双向电泳图谱库，这些图谱中的蛋白主要分布在分子量15～90KD，等电点3.5～9.5之间。利用肽质量指纹图谱鉴定了羽化前后50个分离明显的蛋白点，其中的38个蛋白点得到了良好的鉴定结果。在成功鉴定的38个蛋白点里面，其中包括五种蛋白抑制剂：CI-8A、CI-2、antichymotrypsin precursor、antitrypsin precursor、inhibitor of apoptosis 1，三种与代谢途径相关的酶：beta-N-acetylglucosaminidase isoform A、aminoacylase、hydroxypyruvate isomerase，两种与免疫相关的酶：Phenoloxidase subunit 1、hemolin，两种分子伴侣：peptidylprolyl isomerase B、heat shock protein hsp20.1，两种与生物学行为调控相关的蛋白：diapause bioclock protein、dehydroecdysone3-reductase，一种储藏蛋白：Vg，三种小分子量脂蛋白：ApolipophorinD、ApolipophorinⅢ、30k protien。其中dehydroecdysone3-reductase和ApolipophorinD在家蚕中是新发现的蛋白质，并未有过报道。这也预示着血液作为家蚕重要的内环境体系，其中的蛋白质在羽化时参与了许多复杂的生物学过程。2．家蚕羽化前后差异蛋白的比较分析：用Image Master2D Platinum分析软件对蛹6天和羽化当天的血液双向电泳图谱进行蛋白点匹配，在蛹6天的201个点和羽化当天的156个点中有97个点匹配上了，匹配率为54.3417％，同时也说明了相互之间存在着许多差异点。从蛹6天与羽化当天血液的双向电泳图谱中，我们找到了6个差异明显的区域，分别是蛋白酶抑制剂CI-8，蛹期比蛾期表达量高；卵黄原蛋白，蛹期比蛾期表达量高；30K蛋白，蛹期表达量比蛾期高；ApolipophorinD蛋白，它在蛾期并不表达；diapause bioclock protein，它在蛾期也不表达；ApolipophorinⅢ蛋白，它是蛾期高表达的一个蛋白。这些差异的蛋白点有可能揭示羽化这一变态重要时期复杂的生理反应。3．ApolipophorinⅢ基因的克隆及功能初步分析：根据质谱鉴定所得的蛋白质序列有186个氨基酸残基，翻译成cDNA序列，长为623bp，ORF长为560bp，与家蚕基因组序列比对显示ApolipophorinⅢ基因总长为1076bp，有四个外显子，三个内含子。并成功克隆出ApolipophorinⅢ基因的基因组全长，进一步证实了质谱鉴定的准确性。同源性比对发现，该基因在鳞翅目中的同源性较高，其中与天蛾科的同源性最高，而在直翅目中同源性较低。因此，ApolipophorinⅢ基因在进化过程中，鳞翅目之间的进化相对比其它目要保守。SDS-PAGE电泳检测表明，ApolipophorinⅢ蛋白在化蛾前的表达量急剧上升，说明ApolipophorinⅢ蛋白极有可能是参与了蛾期的脂质物质运输，而且还起着极其重要的作用。从芯片结果分析，羽化前ApolipophorinⅢ基因表达量雄高于雌，极有可能是雄蛾的飞行能力比雌蛾强。RT-PCR检测表明，ApolipophorinⅢ基因在很多组织中都有表达，所以它涉及一些其它重要的未知功能。利用家蚕芯片数据，发现在化蛹期间，ApolipophorinⅢ基因的表达量有明显上升，结合血液SDS-PAGE电泳结果来看，ApolipophorinⅢ蛋白在化蛹时并不在血液里合成，而且也并不分泌到血液中，推测ApolipophorinⅢ蛋白有可能在表皮、脂肪体和卵巢等mRNA水平表达量高的组织中合成，可能与蛹期的细胞凋亡和卵巢的发育相关。