生物牙根构建一直是国内外学者致力研究的热点及难点。近年来，组织工程技术在各个领域的成功运用为生物牙根成功构建提供了借鉴。种子细胞、生物支架与诱导微环境是运用组织工程构建器官及组织再生的三大要素。尽管组织工程化的部分牙齿组织再生已有成功报道，但作为包括牙周膜和牙骨质的牙周组织及牙髓组织的生物牙根构建仍未被实现。究其根本，主要是能用于生物牙根构建的理想种子细胞、生物支架及诱导微环境仍未被找到。牙囊细胞是来源于神经脊的细胞，是一群拥有丰富干细胞的异质细胞群。它是牙周细胞的前体细胞，具有较强的多向分化能力，能分化为成骨细胞、成脂细胞、神经细胞等。因此，牙囊细胞有望成为构建包括多种组织的组织工程器官的种子细胞。牙本质基质是一高度矿化又可以任意切割制备为各种形状的材料。同时，它富含丰富的蛋白及因子与牙齿发育及再生密切相关。因此，它既可以作为生物支架材料，又可以作为成牙诱导微环境。基于以上的研究背景，本课题以牙囊细胞为种子细胞，以牙本质基质作为生物支架材料及成牙诱导微环境进行生物牙根构建。此外，为了对生物牙根构建进行更深入的了解，本课题以与牙根发育密切相关的牙囊细胞和上皮根鞘细胞的相互作用进行相关研究以期对牙根发育的相关机理及生物牙根构建策略的完善作进一步探讨。　　所取得的主要研究结果如下：　　1、成牙支架材料及诱导微环境的构建　　为了获得适合于构建形状可预制性牙本质组织的生物支架及诱导微环境，本实验采用梯度脱矿等一系列处理手段进行了大鼠牙本质基质加工，并分别利用苏木精-伊红染色（HE）、电子显微镜扫描（SEM）及免疫组织化学染色（ICH）对经过处理的牙本质基质（TDM）进行形态学及成牙相关蛋白及因子的检测。结果显示，牙本质小管被充分暴露、小管之间的纤维束疏松，这使得蕴藏在TDM内的相关蛋白及因子得以充分释放成为可能。更为重要的是，TDM表达与牙齿发育及再生相关的蛋白及因子。这些结果提示，TDM可以作为成牙构建的生物支架及诱导微环境，这可能会对牙齿组织或全牙的成功构建起到决定性的作用。　　2、牙囊细胞生物学特性的相关研究　　为了评估DFCs是否能作为构建牙本质甚至生物牙根的种子细胞，我们利用茜素红染色、油红O染色、免疫细胞化学染色技术（ICC）及从逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及流式细胞术（FCM）从形态学、蛋白及基因表达及CD分子表型检测方面对DFCs多向分化潜能进行研究，利用单克隆扩增技术及甲苯胺蓝染色对DFCs克隆形成能力进行检测，利用MTT及FCM对TDM对DFCs增殖影响进行分析，利用光学显微镜观察、SEM、投射电子显微镜（TEM）、ICC及RT-PCR对在TDM作用下，DFCs表面结构及超微结构及以及与成牙相关蛋白及因子表达等方面探讨了DFCs是否具有成牙的细胞生物学基础。结果发现，DFCs具有较强的向成脂、成骨、成神经等方向分化潜能，具有较强的克隆形成能力，TDM能促进DFCs增殖。更为重要的是，在TDM的诱导下，能分化为成牙本质样细胞。这些结果提示，DFCs可以作为种子细胞有助于牙齿组织甚至全牙的成功构建。　　为了进一步了解DFCs作为构建生物牙根种子细胞的生物学基础，我们对DFCs进行单克隆挑选并进行扩增，进而从形态学、细胞增殖及分化方面进行分析。结果显示，最终被成功扩增的16个克隆细胞按形态学分类大致可以分为五类；按增殖及细胞状态等可以分为三类；这为进一步以基因及蛋白分类进而更深入认识DFCs亚克隆的生物学特性提供了初步的基础。　　3、牙囊细胞及牙本质基质构建形状可预制性牙本质组织相关试验研究　　通过第一部分试验及第二部分试验研究，我们已经明确TDM具有成牙生物支架及诱导微环境的基础，而DFCs则具有分化为成牙本质细胞的潜能。为了进一步在组织构建层面上验证TDM与DFCs的成牙功能，我们用7天龄大鼠DFCs与TDM复合形成一复合体结构。一方面，对复合体在体外继续培养两周后，用SEM观察完全性牙本质组织是否能被成功构建；另一方面，对复合体进行成年大鼠大网膜下移植，两周及四周后利用HE观察可预制性牙本质组织是否能被成功构建并利用ICH、PKH26示踪及Masson三色染色对移植物进行鉴定。结果显示，复合体在体外孵育2周后，在TDM表面形成具有牙本质小管的牙本质、前期牙本质和成牙本质细胞样结构。复合体大网膜下移植2周及4周后，在TDM表面，具有牙本质小管的牙本质、前期牙本质、成牙本质细胞层及球形矿化等牙本质发育过程中所特有的结构均被观察到。更重要的是，所构建的牙本质组织与预制的TDM支架形态完全一致。而且随着移植时间从2周变更到4周，所构建的组织明显增厚，矿化更为成熟。　　本研究结果充分说明，我们所选用的生物支架材料、诱导微环境及种子细胞相结合构建形状可预制性牙本质组织的方案是可行的。　　4、牙囊细胞及牙本质基质构建生物牙根相关实验研究　　第二部分试验已证明DFCs在TDM诱导下可以分化为成牙本质样细胞，而DFCs是牙周细胞的前体细胞。因此，我们推测，在牙周微环境与牙本质微环境共同作用下，DFCs可能会同时分化为牙周细胞及牙髓细胞，进而有助于构建生物牙根。为了验证这种方案的可行性，我们把DFCs和TDM复合形成复合体后植入牙槽窝4周后取出移植物，并用HE染色、Brdu标记示踪及ICH对移植物进行检测。结果发现，在远离牙槽窝一侧，有包括成牙本质样细胞的牙髓牙本质复合体样结构形成；而在近牙槽窝壁一侧，则有牙周膜牙骨质复合体样结构在支架材料上形成。同时，走形良好的纤维束紧密连接并垂直插入牙骨质与牙槽骨，形成类似正常牙周膜把整个组织悬吊在牙槽窝。ICH结果表明构建的牙周结构及牙髓牙本质复合体样结构与正常牙周组织及牙髓组织有同样的蛋白表达。Brdu标记示踪试验结果提示植入的DFCs积极参与了牙髓牙本质复合体、牙骨质样组织、牙周膜样结构及牙槽骨的形成。　　本研究提示，利用异质性的DFCs作为种子细胞，TDM作为支架材料，TDM与宿主牙槽窝作为联合诱导微环境构建生物牙根的方案是可行的，这为进一步临床试验提供了良好的基础。　　5、牙囊细胞与上皮根鞘细胞相互作用对牙根发育及再生的影响　　DFCs与上皮根鞘细胞（HERSC）是牙根发育不可缺少的细胞。二者的分化转归也与牙根发育密切相关。为了了解DFCs与HERSC在牙根发育中的作用机理及可能对生物牙根构建的作用，本实验采用接触式及非接触式共培养，以TDM为生物支架及诱导微环境，对DFCs与HERSC相互作用进行了系列体内外实验，并用SEM、HE、ICC及实时定量PCR（Real-timePCR）进行相关检测。结果发现，在以TDM为支架材料及诱导微环境作用下，DFCs分泌丰富的细胞外基质形成束状的胶原纤维，而上皮根鞘细胞则以这些纤维束为网络支架并促进矿化。而体内实验也证明了DFCs与HERSC之间的这种相互作用。　　此外，已有研究发现，Wnt通路能抑制成牙骨质细胞分化。为了进一步探讨Wnt通路在牙根发育及再生中可能存在的影响，我们以β-catein抑制剂DKK1为干预手段，观察Wnt通路中关键信号及通路下游相关靶基因的变化。结果发现Wnt通路关键信号分子发生改变进而调控与牙根及牙周发育及再生密切相关的下游靶基因来控制矿化。　　本研究提示，HERSC与DFCs相互影响在牙根发育及再生中发挥了至关重要的作用。而Wnt通路可能也参与了牙根发育及再生的调控。