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研究背景:系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)是一种慢性免疫介导的影响皮肤和各种内脏器官(包括肺脏、胃肠道、心脏和肾脏等)的自身免疫性疾病,是死亡率最高的一种结缔组织病。其典型特征是皮肤和内脏器官的纤维化改变,进而导致组织结构扭曲及器官功能的逐渐丧失。目前为止尚无有效的治疗可以使这种严重疾病完全地康复,因此深入研究疾病发病机制,寻找SSc治疗的新靶点具有非常重要的社会意义。虽然SSc的发病机制尚不完全清楚,先前的研究表明该疾病的临床和病理表现可能是三个不同过程的结果:(1)先天性和适应性免疫系统异常导致自身抗体的产生和细胞介导的自身免疫;(2)微血管内皮细胞和小血管纤维增生性血管病变;(3)成纤维细胞功能障碍导致过多的胶原蛋白和其他基质成分在皮肤、血管和内脏器官中积聚。这三个过程相互作用并相互影响。Th2通路被认为在纤维化的过程中发挥了非常重要的作用,而作为2型免疫反应强力诱导剂的白介素-33(Interleukin 33,IL-33)也被研究证实参与多种纤维化疾病的发生与发展。但IL-33在SSc相关纤维化中的作用及机制尚不清楚。研究目的:本研究以SSc皮肤受累为例,了解SSc患者外周血及皮肤组织中IL-33及其受体Suppression of tumorigenicity 2(ST2)的表达水平,探究其与相关临床指标之间的关系,挖掘其更大的临床意义;探索IL-33对于皮肤成纤维细胞相关功能的影响;检测IL-33/ST2在博来霉素(Bleomycin,BLM)诱导小鼠皮肤纤维化模型皮肤组织中的表达情况,明确IL-33/ST2表达模式在人鼠之间的异同;观察WT小鼠及IL33-/-小鼠诱导SSc模型的皮肤纤维化程度差异,明确IL-33在SSc皮肤纤维化的作用;为SSc患者纤维化的治疗提供一个新的靶点。研究方法:1、收集SSc患者及健康对照的血浆及皮肤标本,酶联免疫吸附试验法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA法)检测血浆中IL33及s ST2水平,并与患者的临床特征(疾病活动度、年龄、病程等)进行相关性分析;根据患者器官受累情况及自身抗体阴阳性进行分组,比较不同组间IL-33及ST2水平差异;运用受试者工作曲线确定诊断最佳阈值;免疫组化法检测皮肤组织中IL-33及其受体ST2的表达及分布情况;免疫荧光法明确IL-33/ST2的细胞表达情况;2、收集健康人皮肤组织,提取原代成纤维细胞进行体外培养,运用IL-33重组蛋白进行刺激,分别用MTT法及Ed U法检测细胞的增殖率;细胞划痕实验观察IL-33对成纤维细胞迁移功能的影响;real-time PCR法和ELISA法、流式微球分析法检测成纤维细胞炎症相关因子和胶原相关蛋白的m RNA及蛋白水平;3、C57BL/6小鼠皮下注射BLM 3w诱导小鼠SSc皮肤纤维化模型,监测小鼠造模期间体重变化,取病变皮肤组织进行HE染色和Masson染色观察病理严重程度,羟脯氨酸检测法反应皮肤胶原含量;免疫组化法检测IL-33/ST2在小鼠病变皮肤局部组织中的表达及分布情况,并与皮肤纤维化指标进行相关性分析;利用IL33-/-敲除鼠诱导BLM皮肤纤维化模型,评估IL-33缺失对于小鼠皮肤纤维化程度的影响,流式细胞数检测外周脾脏及淋巴结T/B细胞,Th/Treg细胞比例变化;甲苯胺蓝染色检测肥大细胞数量变化。研究结果:1、与正常对照相比,SSc患者血浆中s ST2水平显著升高,与疾病活动度(m RSS评分)、年龄、病程均无显著相关性;与抗体是否阳性,器官是否受累均无明显关系;但血浆s ST2可作为协助诊断SSc的一个较好的血清学指标,在3.508ng/ml阈值处,敏感性及特异性分别为77.42%,93.94%。免疫组化及免疫荧光显示SSc患者病变皮肤局部IL-33及其受体ST2表达均明显上调,IL-33主要表达于内皮细胞以及浸润的炎症细胞核内,角质细胞中IL-33由细胞核转位至细胞浆,而ST2则主要表达于角质细胞、内皮细胞、炎症细胞及成纤维细胞胞膜上;2、人皮肤成纤维细胞表达IL-33及ST2受体。与PBS相比,外源给予IL-33虽对于成纤维细胞炎症因子(IL-6,MCP-1等)的表达与释放无明显促进作用,但能明显促进成纤维细胞的增殖、迁移,能诱导成纤维细胞产生胶原;3、小鼠纤维化皮肤局部IL-33表达增高,ST2+细胞数/HPF增多,且均与皮肤纤维化程度(皮肤厚度,羟脯氨酸含量)呈显著正相关关系。皮肤组织匀浆液(组织间液)IL-33水平增高。4、BLM能明显诱导小鼠皮肤发生纤维化,皮肤厚度增加,胶原沉积增加,小鼠整体体重也明显降低。IL33缺失后,BLM诱导的皮肤纤维化程度明显减轻,皮肤局部ST2+细胞数明显减少,但肥大细胞数无明显变化。IL33缺失部分影响IL33-/-小鼠脾脏Th2细胞的分化与增殖,对于T/B总体及Th/Treg分化与增殖无明显影响。研究结论:IL33可能通过直接作用活化成纤维细胞以促进皮肤纤维化,IL33/ST2可能是治疗SSc患者纤维化的一个重要的靶点。血浆s ST2水平可作为协助诊断SSc疾病的一个非常有用的实验室指标。